生物選修3基因工程的基本操作程序上課用第1頁/共95頁能夠發(fā)光的熱帶魚第2頁/共95頁基因工程的基本操作程序（1）目的基因的獲?。?）（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定基因表達(dá)載體的構(gòu)建第3頁/共95頁基因工程的基本操作程序：一：目的基因的獲取

獲取目的基因是實(shí)施基因工程的第一步。目的基因：主要是指能編碼蛋白質(zhì)的基因。例如：與生物抗逆性相關(guān)的基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因等。

第4頁/共95頁獲取目的基因的方法：1.從基因文庫中提取2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增基因組文庫部分基因文庫3.化學(xué)方法人工合成第5頁/共95頁1.什么叫基因文庫？

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。

基因組文庫：用限制酶切割一種生物的全部DNA，可以得到大量的DNA片段，然后將這些DNA片段與載體連接，再轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中去，讓受體菌不停分裂。這樣，每個(gè)受體菌包含有特定的基因組DNA片段，整個(gè)受體菌群體就包含這種生物的全部基因稱為基因組文庫。第6頁/共95頁2、部分基因文庫：部分基因文庫：只包含了一種生物的一部分基因，這種基因文庫叫做部分基因文庫，例：cDNA文庫。用某種生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與常用載體噬菌體或質(zhì)粒載體連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個(gè)細(xì)菌含有一段cDNA，并能繁殖擴(kuò)增，這個(gè)受體菌群體就叫做這種生物的cDNA文庫。第7頁/共95頁基因組文庫的構(gòu)建模式圖通過對(duì)受體菌的培養(yǎng)而儲(chǔ)存基因第8頁/共95頁基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較第9頁/共95頁cDNA文庫和基因組文庫的比較

文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小小大基因中啟動(dòng)子無有基因組中內(nèi)含子無有基因多少某種生物的部分基因某種生物的全部基因物種間的基因交流可以部分基因可以第10頁/共95頁補(bǔ)：原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子

RNA聚合酶能夠識(shí)別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動(dòng)，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。第11頁/共95頁①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動(dòng)子終止子第12頁/共95頁真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：第13頁/共95頁結(jié)構(gòu)基因外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄、加工修飾mRNA第14頁/共95頁結(jié)構(gòu)基因外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄、加工修飾mRNA第15頁/共95頁真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū):外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列

有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA

聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子第16頁/共95頁原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______

和具有調(diào)控作用的______

區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼第17頁/共95頁如何從基因文庫中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息

如：根據(jù)基因的核苷酸序列

基因的功能

基因在染色體上的位置

基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性第18頁/共95頁（1）從基因組文庫中獲?。合拗泼腹w細(xì)胞中的DNA許多DNA片段運(yùn)載體與載體連接受體細(xì)胞產(chǎn)生特定性狀導(dǎo)入外源DNA擴(kuò)增目的基因分離第19頁/共95頁以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，再反轉(zhuǎn)錄酶的催化下反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈DNA，即cDNA，從而獲得所需的基因。（2）從部分基因文庫中獲取（例cDNA文庫的構(gòu)建方法）第20頁/共95頁（3）根據(jù)已知的氨基酸序列人工合成DNA法：根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成第21頁/共95頁上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點(diǎn)？?jī)?yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)從基因組文庫中獲取從部分基因文庫中獲取根據(jù)已知氨基酸合成DNA法操作簡(jiǎn)便廣泛使用工作量大，盲目，專一性差，分離出來的有時(shí)并非一個(gè)基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)操作過程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高專一性最強(qiáng)僅限于合成核苷酸對(duì)較少的簡(jiǎn)單基因，適用范圍小第22頁/共95頁

4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因

稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)穆里斯等人于1988年發(fā)明的。PCR是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。第23頁/共95頁利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第24頁/共95頁1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍第25頁/共95頁模板DNA95℃第26頁/共95頁P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物第27頁/共95頁P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第28頁/共95頁Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)40506070809010010080604020第29頁/共95頁P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束第2輪開始第30頁/共95頁P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq第31頁/共95頁P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束第32頁/共95頁第33頁/共95頁P(yáng)CR的基本反應(yīng)步驟變性90-95?C延伸70-75?C復(fù)性55-60?CPCR總結(jié)：第34頁/共95頁變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA復(fù)性：冷卻至55～60℃部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合延伸：加熱至70～75℃以目的基因?yàn)槟０?，合成互補(bǔ)的新DNA鏈變性復(fù)性延伸第35頁/共95頁①概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)。③前提條件：_______________________；原料：___________、___________、__________________、________________。②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸DNA引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增模板DNA第36頁/共95頁第37頁/共95頁P(yáng)CR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原理原料條件不同點(diǎn)解旋方式場(chǎng)所酶結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子第38頁/共95頁P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

第39頁/共95頁人工合成(基因比較小)DNA合成儀第40頁/共95頁從基因文庫中獲取利用PCR技術(shù)擴(kuò)增利用化學(xué)方法人工合成歸納：獲取目的基因的方法第41頁/共95頁

用一定的_____切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。

將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶相同的黏性末端切口DNA連接酶1.過程:二基因表達(dá)載體構(gòu)建——

核心第42頁/共95頁質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種過程:第43頁/共95頁2.構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。第44頁/共95頁

科學(xué)家在培育抗蟲棉時(shí)，經(jīng)歷了多次失敗，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達(dá)。然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子(抗蟲基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株還是沒有抗蟲能力。科學(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲能力。資料:第45頁/共95頁思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？（P15）

不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：第46頁/共95頁（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；（4）為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子（增強(qiáng)基因啟動(dòng)子工作效率的順式作用序列，能夠在相對(duì)于啟動(dòng)子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都發(fā)揮作用。）等；（5）有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識(shí)基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。第47頁/共95頁3.基因表達(dá)載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因第48頁/共95頁調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因RNA聚合酶半乳糖苷酶酶酶

RNA聚合酶啟動(dòng)子RNA聚合酶啟動(dòng)子：位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)。第49頁/共95頁思考1：

表達(dá)載體為什么一定要有啟動(dòng)子？（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能有利于基因的表達(dá)；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體細(xì)胞無法轉(zhuǎn)錄。第50頁/共95頁思考2：終止子的作用是什么？

終止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄。是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來。思考3：標(biāo)記基因有什么作用？第51頁/共95頁①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)。注意②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵。③啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少。④目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。第52頁/共95頁基因工程技術(shù)路線第53頁/共95頁三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞常用的受體細(xì)胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。（一）轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)第54頁/共95頁（二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞第55頁/共95頁1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法第56頁/共95頁（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①特點(diǎn)：

易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力②原理：

Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。第57頁/共95頁③轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌第58頁/共95頁

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。（2）基因槍法適用于單子葉植物第59頁/共95頁（3）花粉通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。適用于被子植物第60頁/共95頁胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊第61頁/共95頁2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（1）方法：顯微注射法（將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）思考：為什么要用受精卵而不用體細(xì)胞？第62頁/共95頁（2）操作程序:提純含目的基因表達(dá)載體取受精卵顯微注射移植到子宮受精卵發(fā)育新性狀動(dòng)物第63頁/共95頁常用法：Ca2+處理常用菌：大腸桿菌微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞思考：為什么要用Ca2+處理受體細(xì)胞？用Ca2＋處理，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性第64頁/共95頁培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)導(dǎo)入含目的基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌含有氨芐青霉素的完全培養(yǎng)基含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基兩種培養(yǎng)基均不能生長(zhǎng)大腸桿菌Ca2+

處理細(xì)胞形成感受態(tài)細(xì)胞檢測(cè)（培養(yǎng)不具有氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因的大腸桿菌）只有氨芐青霉素抗性基因質(zhì)粒只具有氨芐青霉素抗性基因大腸桿菌不具有氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性積基因的大腸桿菌完全培養(yǎng)基第65頁/共95頁導(dǎo)入接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基大腸桿菌不含抗四環(huán)素基因證明：不存活含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基證明：

大腸桿菌的受體細(xì)胞含有目的基因

四環(huán)素抗性基因

四環(huán)素抗性基因存活如何把導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞篩選出來？存活第66頁/共95頁導(dǎo)入接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基大腸桿菌不含抗四環(huán)素基因證明：不存活含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基證明：大腸桿菌含抗四環(huán)素基因證明：

大腸桿菌的受體細(xì)胞含有目的基因

四環(huán)素抗性基因

四環(huán)素抗性基因完全培養(yǎng)基存活如何把導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞篩選出來？第67頁/共95頁受體生物植物動(dòng)物微生物受體細(xì)胞導(dǎo)入方法受精卵體細(xì)胞受精卵細(xì)胞/個(gè)體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)用Ca2+處理成感受態(tài)細(xì)胞采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的作法正確的是（）

A.將毒素蛋白注射到受精卵中

B.將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入細(xì)菌，用該細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng)

C.將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進(jìn)入受精卵

D.將編碼毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中BC第68頁/共95頁四、目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè):是否插入目的基因是否轉(zhuǎn)錄是否翻譯鑒定:分子水平鑒定個(gè)體生物學(xué)水平鑒定第69頁/共95頁1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因①首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA；（1）方法:DNA分子雜交（2）過程:②

將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針；③

使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中。（一）檢測(cè)第70頁/共95頁基因探針：是一段帶有檢測(cè)標(biāo)記，且序列已知的，與目的基因互補(bǔ)的核酸序列?；蛱结樛ㄟ^分子雜交與目的基因結(jié)合，產(chǎn)生雜交信號(hào)，能從浩翰的基因組中把目的基因顯示出來。第71頁/共95頁DNA分子雜交示意圖

采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。第72頁/共95頁（二）鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）2、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等①方法:分子雜交方法:抗原-抗體雜交②過程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。第73頁/共95頁提取（3）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)第74頁/共95頁若不能表達(dá)，要對(duì)抗蟲基因再進(jìn)行修飾。怎樣檢驗(yàn)抗蟲基因在棉細(xì)胞內(nèi)是否表達(dá)呢？沒有抗蟲基因的棉植株有抗蟲基因的棉植株棉鈴蟲蟲沒有死蟲被殺死沒有表達(dá)目的基因表達(dá)第75頁/共95頁鑒定——抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。第76頁/共95頁類型步驟檢測(cè)內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子檢測(cè)第一步目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞DNA分子雜交（DNA和DNA之間）是否成功顯示出雜交帶第二步目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA分子雜交技術(shù)（DNA和mRNA之間）是否成功顯示出雜交帶第三步目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交是否成功顯示出雜交帶個(gè)體水平鑒定包括抗蟲、抗病的接種實(shí)驗(yàn)，以確定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的活性比較，以確定功能是否相同等。目的基因的表達(dá)和檢測(cè)第77頁/共95頁提示：

①DNA分子雜交技術(shù)首先提取受體細(xì)胞中的DNA，然后高溫解成單鏈，再與同位素標(biāo)記的DNA探針雜交；

②抗原－抗體雜交所用到的抗體是用表達(dá)出的蛋白質(zhì)注射動(dòng)物進(jìn)行免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并提取出而來的。第78頁/共95頁歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化法（微生物）、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（植物）、顯微注射法（動(dòng)物）目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯第79頁/共95頁為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？構(gòu)建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個(gè)體發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫。第80頁/共95頁利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識(shí)，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？

有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。尋根問底：第81頁/共95頁根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機(jī)理,你能分析出農(nóng)桿菌不能將目的基因不能導(dǎo)入單子葉植物的原因嗎?若將一個(gè)抗病基因?qū)胄←溨?理論上講你應(yīng)該怎樣做?①要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因?yàn)椴皇撬械霓r(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；②要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的誘導(dǎo)的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。酚類誘導(dǎo)物主要在雙子葉植物細(xì)胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中第82頁/共95頁4.β-珠蛋白是動(dòng)物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的成分異常時(shí)，動(dòng)物有可能患某種疾病，如鐮刀形細(xì)胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的β-珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進(jìn)行設(shè)計(jì)？（1）從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA)。（2）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動(dòng)子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個(gè)表達(dá)載體。（3）將表達(dá)載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達(dá)載體未進(jìn)入大腸桿菌中，大腸桿菌會(huì)不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長(zhǎng)出大腸桿菌菌落，則表明β-珠蛋白基因已進(jìn)入其中。（4）培養(yǎng)進(jìn)入了β-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎后從中提取β-珠蛋白。第83頁/共95頁①檢測(cè)是否插入目的基因，利用DNA分子雜交技術(shù)，目的基因DNA一條鏈（作探針）與受體細(xì)胞中提取的DNA雜交，看是否有雜交帶。②檢測(cè)是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，利用分子雜交技術(shù)，目的基因DNA一條鏈（作探針）與受體細(xì)胞中提取的mRNA雜交，看是否有雜交帶。③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)?？贵w與蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原－抗體雜交，看是否有雜交帶。④還可以進(jìn)行個(gè)體水平的鑒定，根據(jù)其性狀。提示：①DNA分子雜交技術(shù)首先提取受體細(xì)胞中的DNA，然后高溫解成單鏈，再與同位素標(biāo)記的DNA探針