植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理及要點1.技術(shù)路線目的基因分離植物表達載體的構(gòu)建受體材料的準備遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化組織組織脫分化轉(zhuǎn)化植株篩選煉苗①②pGEM-T③④⑤⑥⑥⑦⑧①銀杏葉RNA提?、诜崔D(zhuǎn)錄cDNA③chs全長cDNA的克?、躎A克隆及測序⑤向chs兩端引入酶切位點⑥雙酶切⑦定向克?、鄬朕r(nóng)桿菌

2.植物表達載體的構(gòu)建例pBI121-chs構(gòu)建pBI121圖譜銀杏chs基因植物表達載體構(gòu)建示意圖chs

β-glucuronidose

NOSter

CaMV35Pchs4.遺傳轉(zhuǎn)化（1）間接轉(zhuǎn)化法——農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法

（2）直接轉(zhuǎn)化法

A、基因槍轉(zhuǎn)化法

B、電擊法

C、花粉管通道法

D、PEG介導基因轉(zhuǎn)化法根癌農(nóng)桿菌

(Agrobacterium

tumefaciens),是一種革蘭氏陰性土壤桿菌,它含有Ti質(zhì)粒,能誘導被侵染的植物細胞形成腫瘤,即誘發(fā)冠癭瘤.Ti質(zhì)粒(包括Ri質(zhì)粒)上有一段轉(zhuǎn)移DNA,在農(nóng)桿菌侵染宿主植物時,這段DNA可以轉(zhuǎn)移進植物細胞,并穩(wěn)定地保留在植物細胞染色體中,變?yōu)橹参锛毎略黾拥囊蝗夯?最終能通過有性世代遺傳給子代。返回基因槍轉(zhuǎn)化法由美國Cornell大學的Sanfor(1987)提出,它的主要原理是將包含目的基因的載體包被在微小的金屬微粒(鎢?；蚪鹆?表面,通過高壓驅(qū)動力加速微粒穿透植物細胞壁,導入受體組織細胞內(nèi),然后通過組織培養(yǎng)再生出完整的植株.微粒上的外源DNA進入細胞后,整合到染色體上并得到表達,從而實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化.。返回花粉管通道法是利用開花植物授粉后形成的花粉管通道,直接將外源目的基因?qū)肷胁痪邆湔＜毎诘穆选⒑献踊蛟缙谂咛ゼ毎?實現(xiàn)目的基因轉(zhuǎn)化.返回PEG介導基因轉(zhuǎn)化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多聚-L-鳥核苷酸(pLO)、磷酸鈣及高pH值條件下誘導原生質(zhì)體攝取外源DNA分子.PEG可促使細胞膜與DNA間接觸與粘連,并通過引起膜表面電荷的紊亂及干擾細胞間的識別,利于細胞膜間的融合以及外源DNA進入原生質(zhì)體.返回表1幾種植物轉(zhuǎn)基因方法比較

轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)化的優(yōu)點轉(zhuǎn)化的缺點DNA間接轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌介導基因轉(zhuǎn)移受體種類，可以在原生質(zhì)體、蛋細胞和細胞團、組織器官或整株等多級水平上進行，方法成熟可靠，簡便易行，周期短，轉(zhuǎn)化率高；轉(zhuǎn)化雙子葉植物為主。大多數(shù)單子葉植物和裸子植物對農(nóng)桿菌的侵入不敏感，限制了該法在禾谷類作物中的應用。轉(zhuǎn)化體常出現(xiàn)“嵌合”現(xiàn)象，需在嚴格條件下加以選擇以淘汰未轉(zhuǎn)化細胞DNA直接轉(zhuǎn)化法（1）基因槍轉(zhuǎn)化法（2）電擊法（3）PEG介導基因轉(zhuǎn)化法（4）花粉管通道法無宿主限制，適用于各種單、雙子葉植物，操作簡單轉(zhuǎn)化效率低，需要專門設備（電擊儀、顯微操作儀或基因槍），多數(shù)需要原生質(zhì)體與愈傷組織，周期太長（電擊法）遺傳轉(zhuǎn)化主要的影響因素：1.預培養(yǎng)時間：一般0~3天，過長不利于侵染2.農(nóng)桿菌濃度：用MS（pH=7.0）鹽溶液調(diào)OD值（一般在0.2~1.0）3.侵染時間：時間應適中，太短轉(zhuǎn)化率低；太高則后期農(nóng)桿菌難以除凈，毒害材料。4.共培養(yǎng)時間5.乙酰丁香酮（AS）處理：處理方式及濃度(A)僅共培養(yǎng)基中加AS(B)僅菌液中加AS(C)菌液和共培養(yǎng)基中均加ASAS使用濃度：50μM~200μM實驗結(jié)論：A與C效果最好且差異不明顯7.轉(zhuǎn)基因苗的篩選與鑒定培養(yǎng)過程中利用標記基因篩選標記基因選擇標記基因(Slectivegene)報告基因(Reportgene)抗生素類選擇基因抗除草劑類選擇基因生物安全性標記類選擇基因……β-D-葡萄糖酸苷酶基因(Gus)熒光素酶基因(Luc)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(Cat)綠色熒光蛋白基因(Gfp)……例Gus檢測原理：β－Ｄ－葡萄糖酸苷酶基因（Gus），催化β－葡萄糖苷酯類物質(zhì)水解。其中很多水解產(chǎn)物具有發(fā)色團或形成熒光物質(zhì)。例：組織化學法測定Gus活性作用底物為X-gluc,產(chǎn)物是一種不可溶的5,5-二溴