第二章發(fā)酵液預處理兩個問題1、為什么要進行發(fā)酵液的預處理?不僅在于分離菌體和其他懸浮顆粒，還著眼于除去部分可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液的性質(zhì)，以利于提取和精制后繼各工序的順利進行。2、如何選擇合適的預處理方法?各種發(fā)酵產(chǎn)品，由于菌種不同和發(fā)酵液特性不同，其預處理方法的選擇也有不同。大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中，也有少數(shù)產(chǎn)物存在于菌體中，或發(fā)酵液和菌體中都含有。對于胞內(nèi)產(chǎn)物，經(jīng)預處理應盡可能使目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到液相，然后經(jīng)固液分離除去固相；對于胞內(nèi)產(chǎn)物，則應首先收集菌體或細胞，經(jīng)細胞破碎后，目的產(chǎn)物進入液相，隨后再將細胞碎片分離。第一節(jié)發(fā)酵液過濾特性的改變一、降低液體粘度常用方法：（1）加水稀釋法：有效（稀釋后過濾速率提高的百分比必須大于加水比才能認為有效）（2）加熱法：同時，在適當溫度和受熱時間下使蛋白質(zhì)凝聚，進一步改善了過濾特性。嚴格控制加熱溫度與時間二、調(diào)整PH等電點法對某一具體的單元操作的作用：改變大分子物質(zhì)的電荷特性，減少堵塞和污染，如膜過濾。一些物質(zhì)（如細胞、細胞碎片、膠休物質(zhì)等）在某個PH下也可能趨于絮凝，有利于過濾進行。三、凝聚與絮凝凝聚與絮凝其處理過程就是將化學藥劑預先投加到懸浮液中，改變細胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，破壞其穩(wěn)定性，使它們聚集成可分離的絮凝體，再進行分離。1、概念上的差別凝聚是指在電解質(zhì)的作用下，由于膠粒之間雙電層排斥作用降低，電位下降，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。絮凝則是指在某些絮凝劑存在下，基于橋架作用，使膠粒形成較大絮凝團的過程。2、凝聚膠體粒子(10-100nm)中性鹽促進下脫穩(wěn)相互聚集成大粒子（1mm）機理：（1）中和粒子表面電荷（2）消除雙電層結構發(fā)酵液的帶電現(xiàn)象發(fā)酵液中的細胞、菌體或蛋白質(zhì)等膠體粒子的表面，一般都帶有電荷，帶電的原因很多，主要是吸附溶液中的離子或自身基團的電離。膠體雙電層結構凝聚值或凝聚價在發(fā)酵液中加入具有高價陽離子的電解質(zhì)，由于能降低雙電層電位和脫除膠粒表面的水化膜，就能導致膠粒間的凝聚作用。電解質(zhì)的凝聚能力可用凝聚值或凝聚價來表示，使膠粒發(fā)生凝聚作用的最小電解質(zhì)濃度（mmol/L），稱為凝聚值或凝聚價。3、絮凝大分子絮凝劑將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)狀，形成絮凝團的過程。機理：架橋作用。絮凝劑通過靜電引力、范德華力或氫鍵的作用，強烈地吸附在膠粒的表面。當一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上，產(chǎn)生橋架聯(lián)接時，就形成了較大的絮團，這就是絮凝作用。高分子絮凝劑的吸附架橋作用常用的絮凝劑聚丙烯酰胺（po1yacry1amide）類和聚乙烯亞胺（polyethyleneimine）衍生物，根據(jù)活性基團在水中解離情況不同，可分為非離子型、陰離子型（含有羧基）和陽離子型（含有胺基）三類。由于聚丙烯酰胺類絮凝劑具有用量少，一般以ppm計量，絮凝體粗大，分離效果好，絮凝速度快以及種類多等優(yōu)點，所以適用范圍廣。聚丙烯酸類陰離子絮凝劑和聚苯乙烯類衍生物。無機高分子聚合物也是較好的一類絮凝劑，如聚合鋁鹽和聚合鐵鹽等。絮凝劑應用優(yōu)化用量控制：最佳用量為粒子表面積約有一半被聚合物覆蓋時所用的絮凝劑量。pH控制固體濃度與粒子尺寸分布電解質(zhì)含量后續(xù)工藝要求凝聚和絮凝在發(fā)酵液預處理中的應用凝聚和絮凝技術能有效的改變細胞菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，使其聚集起來，增大體積以便固液分離，常用于菌體細小而且黏度大的發(fā)酵液的預處理中。四、加入助濾劑1、助濾劑及其作用：最常用的——硅藻土2、使用方法：兩種（1）在過濾介質(zhì)表面預涂助濾劑（2）直接加入發(fā)酵液也可兩種方法同時兼用3、選擇及使用要點（1）根據(jù)目的產(chǎn)物選擇助濾劑品種（2）根據(jù)過濾介質(zhì)和過濾情況選擇助濾劑品種（3）粒度選擇：必須與懸浮液中固體粒子的尺寸相適應（4）使用量的選擇：合適第二節(jié)發(fā)酵液的相對純化為什么要純化？對于不同的雜質(zhì)，要選擇不同的方法。一、高價無機離子的除去發(fā)酵液中主要的無機離子有Ca2+，Mg2+，F(xiàn)e3+

1、Ca2+的除去為了去除鈣離子，宜加入草酸。但草酸溶解度較小，故用量大時，可用其可溶性鹽，如草酸鈉。反應生成的草酸鈣還能促使蛋白質(zhì)凝固，提高濾液（也稱為原液）質(zhì)量。但草酸價格較貴，應注意回收。如四環(huán)類抗生素廢液中，加入硫酸鉛，在60℃下反應生成草酸鉛。后者在90~95℃下用硫酸分解，經(jīng)過濾、冷卻、結晶后可以回收草酸。2、Mg2+，F(xiàn)e3+的除去草酸鎂的溶解度較大，故加入草酸不能除盡鎂離子。要除去鎂離子，可以加入三聚磷酸鈉Na5P3O10，它和鎂離子形成可溶性絡合物：Na5P3O10＋Mg2+→MgNa3P3O10＋2Na+

用磷酸鹽處理，也能大大降低鈣離子和鎂離子的濃度。要除去鐵離子，可加入黃血鹽，使形成普魯士藍沉淀:4Fe3++3K4Fe(CN)6→Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+（2）變性法：蛋白質(zhì)從有規(guī)則的排列變成不規(guī)則結構的過程稱為變性。變性蛋白質(zhì)溶解度較小。最常用的使蛋白質(zhì)變性的方法是加熱。加熱還能使液體粘度降低，加快過濾速度。檸檬酸發(fā)酵液，采用加熱至80℃以上，使蛋白質(zhì)變性凝固和降低發(fā)酵液粘度，從而大大提高了過濾速度。變性的其它方法：大幅度調(diào)節(jié)PH，加有機溶劑鏈霉素生產(chǎn)中，采用調(diào)pH至酸性（pH3.0），加熱至70℃，維持半個小時的方法來去除蛋白質(zhì)，能使過濾速度增大10-100倍，濾液粘度可降低1/6。注意：加熱法只適合對熱穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端PH會導致某些目的產(chǎn)物失活，且消耗大量酸堿；而有機溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合。（3）吸附法利用吸附作用也可除去蛋白質(zhì)。四環(huán)類抗生素生產(chǎn)中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀K2Zn3[Fe(CN)5]2的膠狀沉淀來吸附蛋白質(zhì)，利用此法除蛋白質(zhì)已取得很好的效果。在枯草桿菌發(fā)酵液中，常加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，這兩者本身生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，從而加快了過濾速度。一、重力沉降雖然簡便易行，但速度很慢?？上扔媚刍蛐跄夹g使顆粒變大，再使用。使用場合有限二、離心分離借助離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分離的技術。最廣泛使用的非均相分離手段，細胞的收集、細胞碎片和沉淀的分離等常用離心分離。超速離心技術已成為分離、純化、鑒別和各種生物大分子的重要手段之一1、沉降系數(shù)S單位離心力作用下粒子的沉降速度，以Svedberg表示，簡稱S。1S=1×10-13s離心沉降速度沉降速度是指在強大離心力作用下，單位時間內(nèi)物質(zhì)運動的距離。是離心設備的一個重要技術指標，是其所能達到的離心力與重力的比值。2、離心力離心力(Centrifugalforce)：離心力作為真實的力根本就不存在，在非慣性系中為計算方便假想的一個力。相對離心力（Relativecentrifugalforce，RCF）：通常離心力常用地球引力的倍數(shù)來表示，指在離心場中，作用于顆粒的離心力相當于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度“g”。

注：n(rpm)應折換成轉(zhuǎn)/秒一般情況下，低速離心時常以轉(zhuǎn)速“rpm”來表示，高速離心時則以“g”表示。3、離心機的種類與用途按轉(zhuǎn)速分：常速（低速）、高速和超速（1）、常速離心機<8000r/min，RCF<1×104g用途：分離細胞、細胞碎片、培養(yǎng)基殘渣及粗結晶等較大顆粒（2）、高速離心機1×104g～2.5×104r/min，RCF1×104g～105g用途：分離各種沉淀物、細胞碎片及較大的細胞器等高速冷凍離心機（3）、超速離心機2.5×104r/min～8×104r/min，RCF5×105g或更高結構：離心管帽、冷凍裝置和溫控系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、安全保護系統(tǒng)、制動系統(tǒng)、指示儀表等。按用途分：制備用超速離心機：分離純化生物大分子、細胞器和病毒等分析用超速離心機：測定樣品純度（根據(jù)紫外吸收率或折光率等判斷）、沉降系數(shù)、相對分子量4、離心方法的選擇對于常速和高速離心機，由于所分離的顆粒大小和密度相差較大，只要選擇好離心速度和時間，就能達到分離效果。超速離心的離心方法：差速離心、密度梯度離心和等密度梯度離心（1）差速離心采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。主要用于分離大小和密度差異較大的顆粒。（2）密度梯度離心樣品在密度梯度介質(zhì)中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)得以分離的一種區(qū)帶分離方法。密度梯度系統(tǒng)：梯度介質(zhì)有足夠大的溶解度，不與分離組分反應，不會引起分離組分的凝集、變性或失活。常用介質(zhì)：蔗糖、甘油等。樣品鋪在密度梯度溶液表面，離心后形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。梯度混合器（3）等密度離心當欲分離的不同顆粒的密度范圍在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)時，不同浮力密度的物質(zhì)顆粒在離心力作用下一直移動到與各自浮力密度相等的位置（等密度點），形成區(qū)帶。等密度離心常用的介質(zhì)：銫鹽，如CsCl，Cs2SO4，CsBr5、離心條件的確定離心力（轉(zhuǎn)速）離心時間溫度pH值6、離心機械管式離心機分為液－液分離的連續(xù)式管式離心機和液固分離的間歇式管式離心機。結構簡單轉(zhuǎn)速很高有利于蛋白質(zhì)的分離間歇操作碟片式離心機是一種應用最廣泛的離心機有一個密封的轉(zhuǎn)鼓，內(nèi)裝十至上百個錐頂角為60~100゜錐形碟片。固體的沉降距離極短，分離效果較好。碟片間的距離一般為0.5~2.5mm,與被分離物料的性質(zhì)有關。分類人工排渣的碟片離心機噴嘴排渣的碟片離心機活門（活塞）排渣的碟片離心機活門排渣的噴嘴碟片式離心機（這是近年來開發(fā)的機型，它和相同直徑的活塞機相似，其速度可增加23%~30%,故可使分離因素達15000左右，該機型可用于酶制劑，疫苗和胰島素生產(chǎn)中分離物的澄清，醇的生產(chǎn)中細菌的采集以及r-DNA中采集和澄清。三、過濾（Filtration)過濾操作是借助于過濾介質(zhì)，在一定的壓力差ΔP作用下，將懸浮液中的固體粒子截留，而與液體分離的技術。衡量過濾特性的主要指標是濾餅的重量比阻rB，它表示單位濾餅厚度的阻力系數(shù)，與濾餅的結構特性有關。對于不可壓縮性濾餅，比阻值為常數(shù)，但對于可壓縮性濾餅，比阻rB，是操作壓力差的函數(shù)影響過濾的因素菌種：真菌，放線菌，細菌培養(yǎng)基：黃豆，花生，淀粉，后期加油，培養(yǎng)基未用完發(fā)酵時間：菌絲自溶前放罐黏度（發(fā)酵液）過濾的難易程度根據(jù)濾餅的重量比阻值，可衡量各種不同發(fā)酵液過濾的難易程度。一般，真菌的菌絲比較粗大，如青霉素的重量比阻為（0.15~0.20）×l012m／kg左右，發(fā)酵液容易過濾，常不需特殊處理。放線菌發(fā)酵液菌絲細而分枝，交織成網(wǎng)絡狀，如鏈霉素重量比阻為2000×1012m/kg左右，過濾較困難，一般需經(jīng)預處理。改善過濾方法分類：（1）澄清過濾：將硅藻土、砂芯、顆?；钚蕴?、玻璃珠、塑料顆粒等過濾介質(zhì)填充于過濾器內(nèi)構成過濾層（也有燒潔的陶瓷、金屬制成的成型顆粒濾層），當懸浮液通過時，固體顆粒被阻攔馬吸附在濾層的顆粒上，使濾液得以澄清。特點：過濾介質(zhì)起主要的過濾作用，適合于固體含量少于0.1g/100ml，顆粒直徑在5—100um的懸浮液的分離。（2）濾餅過濾（濾渣過濾）：以濾布（天然或合成纖維織布、金屬織布，及氈、石棉板、玻動纖維紙、合成纖維等天紡布）為過濾介質(zhì)，當懸浮液通過濾布時，固體顆粒被濾布所阻攔逐漸形成濾餅（濾渣），當濾餅至一定厚度時即起過濾作用。特點：濾餅起主要的過濾作用，適合于固體容量大于0.1g/100ml（懸浮液的過濾分離）。下面介紹板框過濾和真空轉(zhuǎn)鼓過濾和錯流過濾。板框過濾在發(fā)酵工業(yè)中廣泛應用框的形式在板與框的角上均開有孔，組合后即構成供濾漿和洗滌水流通的孔道。濾框上角的孔有小通道與框內(nèi)的空間相通，為濾漿的進入口。濾框的兩側(cè)覆以濾布，圍成容納濾漿和濾餅的空間。濾板有洗滌板和非洗滌板兩種，它們的結構與作用有所不同，圖中圖(a)表示的為非洗滌板，圖(b)為洗板，非洗滌板右下角的孔與板面兩側(cè)相通，可排出洗滌液；洗板左上角的孔與板面的兩側(cè)相通，洗滌液可以由此通入。板和框的結構板框過濾機真空轉(zhuǎn)鼓過濾大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，常用的過濾設備之一（1）工作過程①過濾轉(zhuǎn)鼓下部浸沒于待過濾的懸浮區(qū)中（過濾區(qū)），濾液在大氣壓的作用下透過濾布進入轉(zhuǎn)鼓內(nèi)腔（有一定真空度），濾渣留在轉(zhuǎn)鼓表面的過濾介質(zhì)上形成濾餅。②當轉(zhuǎn)鼓繼續(xù)轉(zhuǎn)動，生成的濾餅被洗滌吸干（洗滌吸干區(qū)）和卸除（卸渣區(qū)）③為了除去堵塞在濾布孔隙中的細微顆粒，壓縮空氣閥進入再生區(qū)，吹落這些微粒，使濾布再生。轉(zhuǎn)周一個過濾循環(huán)。（2）特點①自動化程度高、操