基因重組與基因工程GeneticRecombinationandGeneticEngineering

第一節(jié)

重組DNA技術(shù)DNARecombinationTechnique一、相關(guān)概念DNA克隆工具酶目的基因基因載體二、基本原理及操作步驟本節(jié)主要內(nèi)容DNA克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)。生物技術(shù)工程:基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細胞工程等。目的①分離獲得某一目的基因或DNA②獲得目的基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(geneticengineering)

——實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作，又稱重組DNA技術(shù)。（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶Ⅰ逆轉(zhuǎn)錄酶T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基作用：與甲基化酶共同構(gòu)成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA。分類：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類（基因工程技術(shù)中常用的是Ⅱ類）第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTADNA聚合酶和DNA連接酶DNA連接酶催化5’和3’端形成磷酸二酯鍵，底物為帶缺口的DNA、黏端DNA或平端DNA。GGATCTCCTAGAGCCTAGGATCTA+BamHⅠ（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達載體。載體的選擇標準含有復(fù)制起始點，能在宿主中獨立復(fù)制；分子量小，以容納較大的外源DNA；不能插入宿主基因組，易于分離和純化；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），由限制性內(nèi)切酶的識別序列組成。λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。?.噬菌體(phage)：適用于大片段DNA的克隆M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)動物病毒DNA改造的載體腺病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體桿狀病毒載體其他二、重組DNA技術(shù)基本原理目的基因的獲取重組DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達

1.化學(xué)合成法由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列組織或細胞染色體DNA基因片段克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌存在于轉(zhuǎn)化細菌內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合2.基因組DNA文庫限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫mRNA

cDNA

雙鏈cDNA

重組DNA分子

cDNA文庫

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制3.cDNA文庫逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTTDNA序列是已知的，或兩端已知，可以利用選擇性體外擴增DNA的方法——PCR。是一種在體外利用酶促反應(yīng)大量獲得特異序列的基因組DNA或cDNA的專門技術(shù)，又稱為無細胞的分子克隆。4.聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）模板DNA引物4種dNTPTaqDNA聚合酶含Mg2+的緩沖液。PCR的反應(yīng)體系

（1）變性，加熱至95℃，使模板DNA解開成單鏈；（2）退火，溫度降至適宜，使引物與模板互補結(jié)合；（3）延伸，溫度升至72℃，DNA聚合酶以4種dNTP為底物，在引物的3’-OH上，合成與模板互補的DNA新鏈。PCR的基本反應(yīng)步驟及原理

PCR反應(yīng)條件

變性95?C延伸72?C退火Tm-5?CTm指的是把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時的溫度

PCR反應(yīng)的基本原理（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接不同限制酶切位點的連接EcoRⅠ切割位點BglⅡ切割位點+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。2.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連3.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nTT(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體4.人工接頭(linker)連接由平端加上帶有新的酶切位點的接頭，再用限制性酶切產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠ受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌（五）重組體的篩選1.直接選擇法(1)抗藥性標記選擇(2)標志補救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡

2.免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等(插入失活法)抗藥性標記選擇組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進組氨酸合成λDNA重組體標志補救

α

互補的檢測重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交表達體系的建立表達載體的構(gòu)建受體細胞的建立表達產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達1.原核表達體系（E.coli表達體系最為常用）標準：選擇標志 強啟動子翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點E.coli表達體系的不足

不宜表達真核基因組DNA不能加工表達的真核蛋白質(zhì)表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusionbody)

很難表達大量可溶性蛋白優(yōu)點：可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當修飾表達的蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點：操作技術(shù)難、費時、費錢轉(zhuǎn)染

——將表達載體導(dǎo)入真核細胞的過程方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染顯微注射2.真核表達體系

酵母、昆蟲、哺乳類動物細胞表達載體pFASTBACI的物理圖譜（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認識疾病的分子機制。三、重組技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系（二）生物制藥重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進凝血顆粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子剌激白細胞生成促紅細胞生成素剌激白細胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進行診斷試驗、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預(yù)防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂基因診斷(geneticdiagnosis)是利用分子生物學(xué)及分子遺傳的技術(shù)和原理，在DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。（三）基因診斷基本過程區(qū)分或鑒定DNA的異常分離、擴增待測的DNA片斷標準.能正確擴增靶基因；.能準確區(qū)分單個堿基的差別；.本底或噪聲低，不干擾DNA的鑒定;.便于完全自動化操作，適合大面積、大人群普查。（四）基因治療定義基因治療(genetherapy)是向有