兩個(gè)或兩個(gè)以上的蛋白質(zhì)結(jié)合在一起執(zhí)行生物學(xué)功能時(shí)，發(fā)生相互作用。使蛋白質(zhì)到發(fā)揮作用的位點(diǎn)。使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，激活或抑制。蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用和識(shí)別在諸如生物催化、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫、細(xì)胞調(diào)控等多種生命過程起著重要的作用。第三節(jié)蛋白質(zhì)的相互作用的研究方法免疫共沉淀Co-immunoprecipitation(Co-IP)GSTpull-downassay熒光共振能量轉(zhuǎn)移FluorescentResonantEnergyTransfer（FRET）雙分子熒光互補(bǔ)（BimolecularFluorescentComplement）BIFC酵母雙雜交系統(tǒng)YeastTwo-HybridSysterm其它方法2.方法1)收獲培養(yǎng)的細(xì)胞（1×107－1×108）冷PBS洗滌2次2）細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，冰浴30min3)12000rpm離心30min4）收集上清并加入適量抗體，4oC搖動(dòng)1h～過夜5）加入ProteinA/G-Sepharose(瓊脂糖凝膠)懸液，4oC搖動(dòng)1h6）細(xì)胞裂解液洗滌ProteinA/G-Sepharose混合液7）離心棄上清8）沉淀加2×蛋白LoadingBuffer煮沸5－10min9）離心，上清液跑SDS膠10）考馬氏亮蘭染色、銀染W(wǎng)esternBlot質(zhì)譜分析3.注意事項(xiàng)1）細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或TritonX-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種蛋白酶酶抑制劑，如商品化的cocktailer。2）使用明確的抗體，有的抗體不適宜做免疫共沉淀。3)對照實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)。二、GST融合蛋白進(jìn)行Pulldow實(shí)驗(yàn)

1原理細(xì)菌表達(dá)的谷胱甘肽s－轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的親和純化，也可以將GST融合蛋白作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白結(jié)合，然后根據(jù)谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GST融合蛋白的能力來確定相互作用的蛋白。一般在得到目標(biāo)蛋白的抗體前，或發(fā)現(xiàn)抗體干擾蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)之間的相互作用時(shí)，可以啟用GST沉降技術(shù)。該方法只是用于確定體外的相互作用。

兩種應(yīng)用：1）確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用2）證實(shí)探針蛋白與已知蛋白質(zhì)間可疑的相互作用

GST-PulldownAssay三、Fluorescenceresonanceenergytransfer熒光信號(hào)的產(chǎn)生

熒光基團(tuán)在某波長的激發(fā)光刺激下，產(chǎn)生一個(gè)更長波長的發(fā)射光。什么是FRET?當(dāng)某個(gè)熒光基團(tuán)的發(fā)射譜與另一熒光基團(tuán)的吸收光譜發(fā)生重疊，且兩個(gè)基團(tuán)距離足夠近時(shí)，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團(tuán)傳遞到長波長（低能量）的熒光基團(tuán)，這個(gè)過程稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET),實(shí)際相當(dāng)于將短波長熒光基團(tuán)釋放的熒光屏蔽。OsamuShimomura

OsamuShimomurainthelabinthebasementofhishome.Heisholdingasampleof“real”GFPisolatedfromAequoreavictorea,notproducedbybacteria.

InordertodohisresearchShimomuraestimatesthathecollectedoveramillionAequoreaspecimens。（OneAequoreaweighabout50g）WilliamWard(right)metDouglasPrasheronajellyfish-huntingexpeditioninthe1980s

DouglasPrasherwasthefirstpersontorealizethepotentialofGFPasatracermolecule.GFPcouldbeusedtoreportwhenaproteinwasbeingmadeinacell.GFPcouldpotentiallybeaveryusefulreportermolecule.容易檢測分子量小不需要其它底物DouglasPrasher1992克隆了GFP基因SergeyA.Lukyanov在珊瑚中發(fā)現(xiàn)了類似GFP的蛋白。他還發(fā)現(xiàn)了紅色熒光蛋白。RogerTsien對GFP的機(jī)理作出了貢獻(xiàn)。制造了很多GFP突變體。GFPsequenceMSKGEELFTGVVPVLVELDGDVNGQKFSVSGEGEGDATYGKLTLNFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFYKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKMEYNYNSHNVYIMGDKPKNGIKVNFKIRHNIKDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMILLEFVTAARITHGMDELYK2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)GFP主要應(yīng)用:

對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動(dòng)態(tài)觀察可實(shí)時(shí)原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長、分裂、分化過程中或外界刺激因子的作用下的時(shí)空表達(dá),如某種轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)位、蛋白激酶C的膜轉(zhuǎn)位等。GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞,可動(dòng)態(tài)觀察該分泌蛋白分泌到細(xì)胞外的過程GFP基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因相連,就能顯示活細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及病理過程。膜蛋白的移動(dòng)（FluorescenceRecoveryAfterPhotobleachingFRAP）蛋白之間的相互作用（FRET）報(bào)告分子將GFP的基因連在特殊的啟動(dòng)子的后面，可以檢測基因表達(dá)的時(shí)間和部位。人們在GFP基因的基礎(chǔ)上已經(jīng)制造出藍(lán)色熒光蛋白，黃色熒光蛋白，青色熒光蛋白，又發(fā)現(xiàn)了紅色熒光蛋白。其中蘭色熒光蛋白和綠色熒光蛋白青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白之間可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移四、BimolecularFluorescentComplementation

根據(jù)這一特點(diǎn)，如果使可能存在相互作用的兩種蛋白X和Y分別以和BD/AD形成雜合蛋白的形式的酵母中表達(dá)分布于細(xì)胞核中，X與Y之間的相互作用就可以將BD和AD在空間結(jié)構(gòu)上重新聯(lián)結(jié)為一個(gè)整體而與報(bào)告基因的上游激活序列（upstreamactivationsequence）結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮激活轉(zhuǎn)錄的功能，使受調(diào)控的報(bào)告基因得到表達(dá)。根據(jù)這一原理，雙雜交系統(tǒng)通過簡便的酵母遺傳分析對報(bào)告基因表型進(jìn)行檢測即可實(shí)現(xiàn)對于蛋白質(zhì)間相互作用的研究。

酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報(bào)告基因的表達(dá)探測蛋白－蛋白的相互作用。主要有二類載體:a含DNA-bindingdomain的載體;b含Transcription-activatingdomain的載體。另外還需要特殊的酵母菌株如GAL4缺陷型。1）兩種蛋白之間是否有相互作用2）尋找一種蛋白可能的相互作用蛋白2.應(yīng)用

（1）它并非對所有蛋白質(zhì)適用。

融合蛋白的相互作用激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄是在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生的，而表達(dá)的融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)能否正確折疊并運(yùn)至核內(nèi)是檢測的前提條件。雖然目前已經(jīng)在表達(dá)質(zhì)粒中插入了核定位序列，但仍不能排除不少必須經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器進(jìn)行翻譯后加工修飾的蛋白質(zhì)尤其是胞外蛋白不能進(jìn)入核內(nèi)，或因產(chǎn)生錯(cuò)誤的構(gòu)象而影響篩查結(jié)果.3.雙雜交系統(tǒng)的缺陷

（2）假陽性的發(fā)生較為繁多。在篩庫過程中遇到的假陽性可被簡單分成三型：Ⅰ型：表達(dá)單獨(dú)的AD-Y融合蛋白即可激活轉(zhuǎn)錄。Ⅱ型：表達(dá)AD-Y融合蛋白和空BD載體即可激活轉(zhuǎn)錄。Ⅲ型：表達(dá)AD-Y融合蛋白與任意BD融合蛋白即可激活轉(zhuǎn)錄。3.雙雜交系統(tǒng)的缺陷

（3）在某些酵母菌株中大量表達(dá)外源蛋白質(zhì)常會(huì)帶來毒性作用，從而影響菌株生長及報(bào)告基因的表型。為了抑制背景表達(dá)而在培養(yǎng)其中添加的3-AT（3-Aminotriazole)或6-Azauracil也對菌株有一定毒性，使一些蛋白質(zhì)間較弱的相互作用可能會(huì)因此而被掩蓋。（4）還應(yīng)意識(shí)到的一點(diǎn)是，雖然雙雜交系統(tǒng)可篩選出大量蛋白質(zhì)相互作用