質粒酶切鑒定第1頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日1.實驗目的和要求學習和掌握限制性內切酶的特性、酶解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法，并理解限制性內切酶是DNA重組技術的關鍵工具，瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定DNA片段的有效方法。第2頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日2.相關基礎知識

限制性核酸內切酶：是一類能識別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。是體外剪切基因片段的重要工具，所以常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。限制性核酸內切酶不僅是DNA重組中重要的工具，而且還可以用于基因組酶切圖譜的鑒定。第3頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日1)寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象2)核酸限制性內切酶的類型3)核酸限制性內切酶的基本特性4)同裂酶和同尾酶5)核酸限制性內切酶的命名法6)影響核酸限制性內切酶活性的因素第4頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日1)寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象限制與修飾系統(tǒng)是細胞的一種防衛(wèi)手段。各種細菌都能合成一種或幾種能夠切割DNA雙鏈的核酸內切酶，它們以此來限制外源DNA存在于自身細胞內，但合成這種酶的細胞自身的DNA不受影響，因為這種細胞還合成了一種修飾酶，對自身的DNA進行了修飾，限制性酶對修飾過的DNA不能起作用。這種現(xiàn)象被稱為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象。第5頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日2)限制性核酸內切酶的類型及特性按限制酶的組成、與修飾酶活性關系以及切斷核酸的情況不同，分為三類：Ⅰ型Ⅱ型*Ⅲ型第6頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日第一類（I型）限制性內切酶能識別專一的核苷酸順序，并在識別點附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內切酶在DNA重組技術或基因工程中用處不大，無法用于分析DNA結構或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。第7頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日第二類(II型)限制性內切酶能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的。因此，這種限制性內切酶是DNA重組技術中最常用的工具酶之一。這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是4個或6個核苷酸，少數(shù)也有識別5個核苷酸以及7個、8個、9個、10個和11個核苷酸的。II型限制性內切酶的識別順序是一個回文對稱順序，即有一個中心對稱軸，從這個軸朝二個方向“讀”都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式：第8頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日粘性末端；是交錯切割，結果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。如EcoRI的識別順序為：5’……G’AA|TT_C……3’3’……C_TT|AA’G……5’垂直線表示中心對稱軸，從兩側“讀”核苷酸順序都是GAATTC或CTTAAG，這就是回文順序（palindrome）。_和‘表示在雙鏈上交錯切割的位置，切割后生成5’……G和AATTC……3’、3’……CTTAA和G……5’二個DNA片段，各有一個單鏈末端，二條單鏈是互補的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過DNA連接酶的作用而“粘合”。第9頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日II型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產生平頭末端。例如EcoRV的識別位置是：5’……GAT’|ATC……3’3’……CTA’|TAG……5’

切割后形成5’……GAT和ATC……3’、3’……CTA和TAG……5’。這種末端同樣可以通過DNA連接酶連接起來。平頭末端：第10頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日第三類（III型）限制性內切酶也有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序,在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對不是特異性的。因此，這種限制性內切酶切割后產生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此不能應用于基因克隆。第11頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日同裂酶：有時兩種限制性內切酶的識別核苷酸順序和切割位置都相同，其差別只在于當識別順序中有甲基化的核苷酸時，一種限制性內切酶可以切割，另一種則不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的識別順序都是5’……G’CG_G……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，則只有HpaⅡ能夠切割。這些有相同切點的酶稱為同裂酶（同切酶或異源同工酶）。3）同裂酶和同尾酶：第12頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日有時兩種酶切割序列不完全相同，但卻能產生相同的粘性末端，這類酶被稱為同尾酶，可以通過DNA連接酶將這類末端連接起來，但原來的酶切位點將被破壞，有時可能會產生一個新的酶切位點。如Xba1、Nhe1、Spe1以及Styl切割的DNA序列不同，但均給出相同的“CTAG”粘性末端。這些粘性末端連接后，以上的酶將不能再切割，但卻產生了一個新的4核苷酸的酶切位點，即Bfa1的酶切位點。同尾酶：第13頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日4)限制性核酸內切酶的命名法用屬名的頭一個字母和種名的頭兩個字母表示寄主菌的物種名稱，如E.coli

用Eco表示，所以用斜體字。用一個字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd菌株用d，即Hind。如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個不同的限制與修飾體，則以羅馬數(shù)字表示，如HindⅠ,HindⅡ，HindⅢ等。第14頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日5)影響核酸限制性內切酶活性的因素(1)DNA的純度；(2)DNA的甲基化程度；(3)酶切消化反應的溫度；(4)DNA的分子結構；(5)溶液中離子濃度及種類；(6)緩沖液的pH值。第15頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是利用瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶有一定孔隙的固體基質的特性，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場的作用下及中性pH的緩沖條件下帶負電的核酸分子就可以向陽極遷移。影響DNA在瓊脂糖中遷移率的因素：DNA分子的大小、DNA的構象、電壓、電場方向、堿基組成、嵌入的燃料以及電泳緩沖液的組成。第16頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日瓊脂糖凝的濃度影響給定大小的線狀DNA的遷移率，因此采用不同濃度的凝膠可以分離不同大小范圍的DNA片段。0.8%的瓊脂糖凝膠能很好地分辨1-25kb的片段；0.5%的瓊脂糖凝膠用于分辨較大片段的DNA(20-100kb）；對于小片段的DNA(0.2-2kb)可用1.5%或更高濃度的凝膠進行分離。不過，以上這些并不是絕對的，因為有時我們需要同時分離多種分子量相差較大的片段，因此所用瓊脂糖凝膠的濃度要視情況而定。第17頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲錠溴鹽,(EthidiumBromide)。它能夠插入DNA分子中的堿基對之間而與DNA結合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝膠電泳中的DNA條帶呈現(xiàn)出紅色熒光，易于檢測?？梢詸z測10ng的DNA。注意：EB是一種誘變劑，操作時一定要注意安全操作，必須戴塑料或乳膠手套。第18頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日3.實驗材料與儀器質粒pCMV-Myc-T10NEB標準分子量片段(1kbDNALadder)EcoR1和Xho1核酸內切酶（Takara）EcoR1和

Xho1酶解緩沖液(10×Hbuffer)瓊脂糖TBE或TAE緩沖液(10×)溴化乙啶染色液(10mg/ml)上樣液(6×)：0.25%溴酚蘭，40％(W/V)蔗糖水溶液或30％的甘油。第19頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日InsertEcoR1Xho11.9kb質粒第20頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日第21頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日1kbDNALadder不能對DNA質量進行精確定量分析，但可以通過與相近的條帶進行比較估算出大概的數(shù)據(jù)。每條帶大概的量如下（按0.5μg上樣量計。應按12條帶計算，因為3kb的量是其它片段量的近三倍）：片段堿基對質量110,00242ng28,00142ng36,00150ng45,00142ng54,00133ng63,001125ng72,00048ng81,50036ng91,00042ng10a51742ng*10b50042ng*第22頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日EcoRI酶切位點：G'AATT_CXhoI酶切位點：C'TCGA_G10×Hbuffer:500mMTris-HCl(pH7.5)100mMMgCl210mMDithiothreitol1000mMNaCl第23頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日酶活性的定義：一個活性單位（U)，是指在50l反應體系中，37oC的條件下，經過1小時的反應時間，將1gDNA完全酶解所需要的酶量。因為不同的酶所要求的最適反應條件不同，所以一定要使用與酶相匹配的緩沖系統(tǒng)。一般按照銷售酶的公司所提供的相應緩沖液。雙酶切或多酶切時要考慮相容性緩沖液問題，一般公司會給用戶提供這方面的信息。第24頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日電泳儀，電泳槽，紫外透射儀，凝膠成像儀，一次性塑料手套等第25頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日4.實驗方法和步驟

第26頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日質粒量（ng）緩沖液(μl)*EcoR1（μl）Xho1（μl）H2O(μl)總體積（μl）I20020017-1920II20020.5015-1720III20020.50.514-1620*緩沖液隨不同的酶而不同,本實驗用Hbuffer。置于37℃水浴酶解0.5-1小時。酶解完成后，分別加入10l3倍的上樣緩沖液,然后各取15l進行電泳分析。1)質粒DNA的酶解（自提質粒pCMV-Myc-T10）第27頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日2)瓊脂糖凝膠的制備瓊脂糖凝膠液的制備：稱取0.8g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入100mlTBE或TAE工作液，瓶口倒扣一個小燒杯等，將該三角瓶置于微波爐加直至瓊脂溶解。第28頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日3）膠板的制備取有機玻璃內槽，洗凈、晾干；取紙膠條(寬約1cm)，將有機玻璃內槽置于一水平位置模具上，放好梳子。第29頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日將冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠液，小心地倒在有機玻璃內槽上，控制灌膠速度和量，使膠液緩慢地展開，直到在整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置30min左右，待凝固完全后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開的上樣孔。制好膠后將鋪膠的有機玻璃內槽放在含有0.5-1×TAE（Tris-乙酸）

或TBE（Tris-硼酸）工作液的電泳槽中使用。第30頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日4）加樣用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品孔內。每加完一個樣品，換一個加樣頭。加樣時應防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透凝膠底部，本實驗樣品孔容量約15～20l。1kbDNAladder（共10條帶）:在第一個上樣孔或最后一個上樣孔內加入6l的1kbDNAladder（50ng/l）。第31頁，共36頁，2023年，2月20日，星期日5）電泳（帶上手套操作）加完樣后的凝膠板即可通電進行電泳；建議在80～100V的電壓下電泳；當溴酚蘭移動到距離膠板下沿約1cm處停止電泳；將凝膠放入溴化乙啶（EB〕工作液（0.5g/ml左右）中染色約20min。第32頁，共36頁，2023年，2月20日