呋喃西林代謝物單克隆抗體的制備及免疫學(xué)特性鑒定徐冬梅李亞英耿海波李玉靜摘要：為建立咲喃西林代謝物氨基脲（semicarbazide,SEM）的免疫學(xué)檢測(cè)方法，采用碳化二亞胺法成功合成人工免疫抗原SEM-牛血清白蛋白（bovineserumalbumen，BSA）（SEM-BSA），并用該抗原免疫BALB/c小鼠，采用聚乙二醇介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)制備SEM的單克隆抗體（SEMmAb），采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化單抗，并對(duì)其效價(jià)、敏感性、特異性和親和力等免疫學(xué)特性進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：成功制備SEM單克隆抗體SEM-3D9，抗體效價(jià)達(dá)到l：5xl06，敏感性半抑制質(zhì)量濃度為0.42yg/L，亞型為IgGl,親和常數(shù)Ka=2.1xl08L/mol，與咲喃唑酮代謝物2-NP-3-氨基-2-惡唑酮、咲喃它酮代謝物2-NP-5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮類似物的交叉反應(yīng)率（crossreaction，CR）均小于0.01%，與咲喃妥因代謝物2-NP-1-氨基-2-乙內(nèi)酰的CR為0.0168%,特異性良好。關(guān)鍵詞：呋喃西林代謝物;氨基脲;細(xì)胞融合;單克隆抗體;免疫學(xué)特性Abstract：Inordertoestablishanimmunologicalmethodforthedetectionofthefuracillinmetabolitesemicarbazide（SEM），aconjugateofSEMwithbovineserumalbumin（BSA）wassynthesizedbythecarbodiimidemethodandwasusedasanimmunogentoimmunizeBALB/cmiceforthepreparationofamonoclonalantibodyagainstSEM（SEMmAb）bypolyethyleneglycol（PEG）-mediatedcellfusion.SEMmAbwaspurifiedbycaprylicacid-ammoniumsulfateprecipitation.Finally，theimmunologicalcharacteristicsofthemonoclonalantibodyincludingtiter，sensitivity，specificityandaffinitywereidentified.TheresultsshowedthatthemonoclonalantibodySEM-3D9wassuccessfullyprepared.Theserumtiterofimmunizedmicewas1：5x106，thesensitivityIC50was0.42yg/L，andtheantibodybelongedtoIgG1subtypewithanaffinityconstantKaof2.1x108L/mol.Itscross-reactionratewith2-NP-3-amino-2-oxazolidinoneand2-nitrophenyl-5-morpholine-methyl-3-amino-2-oxazolidinoneanalogueswaslessthan0.01%，anditscross-reactionratewith2-nitrophenyl-1-aminohydantoinwas0.0168%，indicatinggoodspecificity.Keywords：furacillinmetabolite;semicarbazide;cellfusion;monoclonalantibody;immunologicalcharacteristicsDOI：10.7506/rlyj1001-8123-20XX1029-253中圖分類號(hào)：TS251.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1001-8123(2020)03-0058-05呋喃西林是一種硝基呋喃類藥物，可抑制或殺滅多種革蘭氏菌以及某些真菌和原蟲，主要用于預(yù)防和治療腸道細(xì)菌感染，在畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到廣泛應(yīng)用［1］，該類藥物及其代謝物屬于硝基雜環(huán)類化合物，具有細(xì)胞誘變性和動(dòng)物致癌毒性［2］，已引起臨床高度重視，歐盟、日本和美國(guó)［3］等大部分國(guó)家和地區(qū)已禁止呋喃西林等4種硝基呋喃類藥物在肉類食品中的殘留，我國(guó)在20XX年也將該類抗生素列為食源性動(dòng)物禁止使用藥物［4］。在4種硝基呋喃類藥物中，呋喃西林類藥物殘留量最多［5］，毒性也最大［6］。在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中呋喃西林類藥物中毒事件時(shí)有報(bào)道［7-8］。呋喃西林在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)被迅速代謝［9］，不易檢測(cè)，其代謝產(chǎn)物氨基脲(semicarbazide,SEM)能與細(xì)胞內(nèi)蛋白長(zhǎng)期結(jié)合，存留較長(zhǎng)時(shí)間［10-12］，因此，通常將其代謝產(chǎn)物作為呋喃西林類藥物殘留檢測(cè)的標(biāo)識(shí)物［13］。目前，咲喃西林代謝物的檢測(cè)方法主要有紫外分光光度法［14-15］、高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography，HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquidchromatography-massspectrometry，LC-MS)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)等儀器方法，以及以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)、膠體金免疫層析為主的免疫學(xué)分析方法［16-17］。傳統(tǒng)紫外分光光度法檢測(cè)靈敏度低，不能滿足微量代謝物檢測(cè)要求。HPLC、LC-MS等方法能隨時(shí)進(jìn)行精確檢測(cè)［18-19］，靈敏、準(zhǔn)確，主要作為確證方法，目前已出臺(tái)多項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，如GB/T18932.24—20XX《蜂蜜中咲喃它酮、咲喃西林、咲喃妥因和咲喃唑酮代謝物殘留量的測(cè)定方法液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》規(guī)定了蜂蜜中呋喃西林代謝物殘留量的LC-MS/MS測(cè)定方法，SN/T3648—20XX《飼料中咲喃唑酮、咲喃妥因、咲喃它酮、咲喃西林含量的檢測(cè)方法液相色譜法》規(guī)定了飼料中咲喃西林含量的HPLC檢測(cè)方法，GB/T22987—20XX《牛奶和奶粉中咲喃它酮、咲喃西林、咲喃妥因和咲喃唑酮代謝物殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》規(guī)定了牛乳和乳粉中咲喃西林代謝物殘留量的LC-MS/MS檢測(cè)方法，但該方法儀器設(shè)備昂貴、操作繁瑣、檢測(cè)成本高，不適合現(xiàn)場(chǎng)批量檢測(cè)，嚴(yán)重影響了使用此方法進(jìn)行非法添加檢測(cè)的監(jiān)管和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警。免疫學(xué)分析方法［20-21］具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、方便、檢測(cè)成本低、分析容量大等優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)批量快速定性及定量分析，已成為目前最有效的初篩技術(shù)手段［22-25］。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已開展了呋喃西林代謝物免疫學(xué)分析方法研究，但受抗體質(zhì)量的限制，方法的檢測(cè)靈敏度和特異性還有待提高，如吳鵬等［26］建立動(dòng)物性食品中呋喃西林代謝物間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，該試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的半抑制質(zhì)量濃度（halfinhibitoryconcentration,IC50）為0.2677yg/L;趙承彪［27］制備了抗咲喃西林多克隆抗體,抗體的敏感性IC50為10.5yg/L。本研究采用碳化二亞胺法［28-29］合成SEM人工抗原，制備其高特異、靈敏的單克隆抗體,并對(duì)抗體的免疫學(xué)特性進(jìn)行鑒定,為呋喃西林代謝物免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立提供1材料與方法材料與試劑骨髓瘤SP2/0細(xì)胞本研究室保存;BALB/c小鼠河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。PEG4000、鹽酸氨基脲（SEM?HC1）、牛血清白蛋白（bovineserumalbumen，BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）生工生物工程（上海）股份有限公司;免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）亞型試劑盒Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司;HAT選擇性培養(yǎng)基美國(guó)Gibico公司;弗氏完全與不完全佐劑Pierce生物技術(shù)公司;SEM與對(duì)羧基苯甲醛的衍生物（CPSEM）、SEM-BSA、SEM-OVA本研究室自制;N-羥基琥珀酰亞胺北京百靈威科技有限公司;1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司;鄰醛基苯甲酸、對(duì)醛基苯甲酸阿拉丁試劑（上海）有限公司;N,N-二甲基甲酰胺上海麥克林生物化學(xué)有限公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG北京中杉金橋生物科技有限公司。儀器與設(shè)備Milli-Qingegrallo超純水系統(tǒng)德國(guó)密理博公司;BS124S電子天平賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司;NanoDrop20XX紫外掃描儀、Micro17超速離心機(jī)、WellwashAC洗板機(jī)賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司;MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱日本Sanyo公司;SW-CJ-1F凈化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司;IX51倒置顯微鏡Olympus（中國(guó)）有限公司;MS105DU電子分析天平梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司;YDS-65-216液氮罐成都金鳳液氮容器有限公司;AvantiJXN-26高速冷凍離心機(jī)德國(guó)BeckmanCoulter公司;DK-S24電熱恒溫水浴鍋上海精宏設(shè)備有限公司;VarioskanLUX酶標(biāo)儀美國(guó)Bio-Tek儀器有限公司。方法SEM人工抗原的合成與鑒定抗原合成采用碳化二亞胺法，鑒定采用紫外分光光度法和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectropheresis,SDS)法［30］,并采用朗伯-比爾定律計(jì)算偶聯(lián)比［31-32］。動(dòng)物免疫用生理鹽水將免疫原CPSEM-BSA稀釋，與等體積弗氏不完全佐劑混勻后頸背部免疫BALB/c小鼠，免疫劑量為40pg/只，免疫4次，每次間隔2周。第4次免疫1周后取血，用間接ELISA法測(cè)定抗血清效價(jià)，競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定抗血清是否敏感，最終選取效價(jià)高、敏感性好的免疫小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。雜交瘤細(xì)胞的制備選擇敏感性好且血清效價(jià)高的小鼠進(jìn)行腹腔加強(qiáng)免疫，3d后用于細(xì)胞融合。采用間接和競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)融合細(xì)胞上清的抗體效價(jià)和對(duì)咲喃西林代謝物的抑制率，采用有限稀釋方法將陽(yáng)性孔克隆化，直至成功建立單一分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株為止，將雜交瘤細(xì)胞株保存于-20:待用。單克隆抗體的制備與純化采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法獲取單克隆抗體。將篩選得到的能穩(wěn)定分泌SEM抗體的雜交瘤細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)約為106個(gè)/mL)注射到石蠟油致敏的BALB/c小鼠腹腔，每只注射1mL，7?10d后取腹水。腹水采用辛酸-硫酸銨方法純化，并采用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)純化的抗體質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定［33］。單克隆抗體抗效價(jià)測(cè)定參照李春生等［34］的方法，采用間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)。單克隆抗體敏感性測(cè)定將咲喃西林代謝物衍生物的標(biāo)準(zhǔn)品母液用磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsaline，PBS)稀釋成質(zhì)量濃度分別為&1、2.7、0.9、0.3、0.1yg/L,采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)SEM抗體敏感性，以IC50表示［35］。單克隆抗體免疫球蛋白亞型鑒定使用單克隆抗體亞型試劑盒測(cè)定抗體亞型。1.3.8單克隆抗體親和常數(shù)(Ka)測(cè)定采用間接ELISA法［36］測(cè)定Ka,按下式計(jì)算。式中：p為當(dāng)抗原質(zhì)量濃度為a時(shí)，吸光度最高值的50%所對(duì)應(yīng)的抗體質(zhì)量濃度/(卩g/mL);p為當(dāng)抗原質(zhì)量濃度為b時(shí)，吸光度最高值的50%所對(duì)應(yīng)的抗體質(zhì)量濃度/(yg/mL);a=nb;n為稀釋倍數(shù)。1.4數(shù)據(jù)處理采用Statistics統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Origin制圖軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2結(jié)果與分析單克隆抗體的獲取4免后,3只小鼠抗血清經(jīng)測(cè)定，效價(jià)均達(dá)到1口105以上,敏感性IC50小于7ng/mLo其中SEM-3號(hào)小鼠抗血清效價(jià)為1：2x105,敏感性IC50小于1.5ng/mL，選擇該小鼠加強(qiáng)免疫后用于細(xì)胞融合。融合5板，融合率達(dá)到88.7%，陽(yáng)性克隆率達(dá)到19.6%，經(jīng)亞克隆，篩選得到1株能夠穩(wěn)定分泌SEM抗體的細(xì)胞株，命名為3D9。擴(kuò)大培養(yǎng)后，采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法制備腹水，腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨法純化后得到抗SEM單克隆抗體，命名為SEM-3D9，經(jīng)測(cè)定抗體質(zhì)量濃度為8.6mg/mL。SEM-3D9效價(jià)測(cè)定結(jié)果P為待測(cè)陽(yáng)性對(duì)照孔A450nm)作為效價(jià)測(cè)定結(jié)果。由表1可知，當(dāng)SEM-3D9稀釋比例為1：512000時(shí)，P/N為3.38，確定SEM-3D9的效價(jià)為1口5"06。SEM-3D9敏感性測(cè)定結(jié)果用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定SEM-3D9對(duì)不同質(zhì)量濃度咲喃西林代謝物2-NP-二硝基苯甲醛酸脲(2-NP-benzaldehydesemicarbazone，NPSEM)的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。以B/B0(%)(B為不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的A450nm，B0為零濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的A450nm)為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)(lgpNPSEM)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，進(jìn)行回歸分析，并計(jì)算IC50。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度0.1?8.1yg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-0.3351X+0.3842(R2=0.9927)，IC50為0.42yg/L。SEM-3D9亞型測(cè)定結(jié)果雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體與不同亞型的免疫球蛋白反應(yīng)后顯色有明顯差異。由圖1可知，SEM-3D9與IgGl抗體反應(yīng)的A450nm最高，與IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA反應(yīng)的A450nm小于0.5,為陰性，因此SEM-3D9單克隆抗體亞型為IgGl。SEM-3D9Ka測(cè)定結(jié)果以SEM-3D9質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),A450nm為縱坐標(biāo)繪制“S”型曲線。由圖2可知，SEM-3D9的Ka為2.1x108L/mol。SEM-3D9特異性測(cè)定結(jié)果通過(guò)將SEM-3D9與NPSEM、咲喃唑酮代謝物2-NP-3-氨基