考馬斯亮藍(lán)G法測(cè)定蛋白質(zhì)含量精第1頁(yè)/共11頁(yè)考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量第2頁(yè)/共11頁(yè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饪捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理掌握考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的操作步驟第3頁(yè)/共11頁(yè)實(shí)驗(yàn)原理考馬斯亮藍(lán)G250在酸性的溶液中游離狀態(tài)呈紅褐色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后呈藍(lán)色，其最大吸收波長(zhǎng)由465nm轉(zhuǎn)變?yōu)?95nm。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，595nm處的光密度值與蛋白質(zhì)濃度成反比，可用比色法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量測(cè)定。第4頁(yè)/共11頁(yè)儀器和試劑1．儀器：分析天平；吸管0.1ml×1、1ml×2、5ml×1；試管10個(gè)；722型分光光度計(jì)；容量瓶100ml、1000ml各一個(gè)；2．試劑：（1）0.9%NaCl溶液；（2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水并定容至100ml，制成0.1mg/ml的原液。（3）考馬斯亮藍(lán)G-250（0.01%）染液：稱取0.1g考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50ml90%乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100ml，最后用蒸餾水定容至1000ml。此溶液不宜久存，在常溫中可放置1-2個(gè)月。（4）樣品液：取牛血清白蛋白0.1mg/ml的溶液，用0.9%NaCl溶液稀釋至一定濃度。第5頁(yè)/共11頁(yè)操作步驟1．0~100μg／mL標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取6支試管，編號(hào)后，按下表加入試劑，混勻，室溫靜置5min后，以管1為空白對(duì)照，在595nm下比色測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。第6頁(yè)/共11頁(yè)管號(hào)123456蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.10.10.10.10.10.9%NaCl溶液（ml）1.00.90.90.90.90.9考馬斯亮藍(lán)染液555555蛋白質(zhì)含量（μg）A595第7頁(yè)/共11頁(yè)2．樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定另取兩支干凈的試管（做一重復(fù)），加入合適濃度的待測(cè)樣品，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，測(cè)定方法同上，由樣品液的吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出含量。第8頁(yè)/共11頁(yè)計(jì)算

樣品的蛋白質(zhì)含量（μg/g鮮重）=[查得的蛋白質(zhì)含量（μg）/[樣品鮮重（g）]第9頁(yè)/共11頁(yè)注意事項(xiàng)1.如果要求嚴(yán)格，最好在試劑加入后的5~20min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)檫@段時(shí)間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。2．測(cè)定中，蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，