第八章基因工程相關(guān)技術(shù)第一節(jié)RNAi第二節(jié)基因芯片第三節(jié)基因信息分析技術(shù)90年代初，RichJorgensen設(shè)想，將更多的色素基因mRNA注入植物體，能使花朵的色彩更艷麗，而結(jié)果出其預(yù)料，轉(zhuǎn)基因的植株不僅沒有新基因表達(dá)，反而使原有的色素基因也受到了抑制，當(dāng)時(shí)稱共抑制（cosuppression)。第一節(jié)RNAi一、RNAi的發(fā)現(xiàn)歷史par21基因反義RNApar21基因正義RNApar21基因沉默par21基因沉默秀麗新小桿線蟲(C.elegans)1995年美國康奈爾大學(xué)Guopar21基因功能：控制極性的建立二、RNAi的定義

RNAi(RNAinterference,RNAi)指將與內(nèi)源性mRNA互補(bǔ)的dsRNA(doublestrandedRNA,dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞后,引起該mRNA特異性的降解，導(dǎo)致mRNA編碼的基因不能表達(dá)，發(fā)生基因沉默。切割A(yù)ssembleintoRISCComplexSmallInhibitingRNA(siRNAs)PerfectBase-pairingtomRNAAAAAAAmRNACleavageandDestruction21dsRNADicerRISC

(RNAinducedsilencingcomplexes)

RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體三、RNAi的原理核酸酶RNaseIII核酸酶*Dicer

dsRNA的核酸酶——屬于RNaseIII核酸酶家族成員，稱為Dicer，是一種ATP依賴性核酸內(nèi)切酶。它包括2個(gè)催化區(qū)、1個(gè)解旋酶區(qū)及dsRNA結(jié)合區(qū)域，在進(jìn)化過程中高度保守。該酶將dsRNA切割成長21-23nt,此片段的3’端有2nt的突出尾。*RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體RNA-inducedsilencingcomplex(RISC),復(fù)合體由21-23ntdsRNA、核酸酶和mRNA組成。當(dāng)RISC復(fù)合物形成，核酸酶降解mRNA。kb=千堿基kilobasent＝核苷酸nucleotidebp＝堿基對basepair

RNAi基因表達(dá)的效應(yīng)可以突破細(xì)胞的界限，在不同的細(xì)胞甚至生物體間傳遞和維持，并可傳遞給子一代。五、RNAi的細(xì)胞間級(jí)聯(lián)反應(yīng)InjectdsRNASeeRNAiresponsehere六、RNAi的應(yīng)用1、防御病毒的感染：dsRNA出現(xiàn)在許多病毒（包括單鏈RNA病毒）感染的細(xì)胞內(nèi)，誘發(fā)RNAi，封閉病毒生存和繁殖所必需的基因，產(chǎn)生抗病毒效應(yīng)。2、基因治療：RNAi作用的高度特異性有可能特異地抑制致病的突變等位基因，但又不影響正常的等位基因。腫瘤是多個(gè)基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)構(gòu)，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單個(gè)癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長，而RNAi可以利用同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計(jì)針對這一序列的dsRNA分子，只導(dǎo)入一種dsRNA既可以產(chǎn)生多個(gè)基因同時(shí)沉默。七、SmallInhibitingRNA(siRNAs)siRNA是一種短片段雙鏈RNA分子，能夠以同源互補(bǔ)序列的mRNA為靶目標(biāo)降解特定的mRNA。切割A(yù)ssembleintoRISCComplexSmallInhibitingRNA(siRNAs)PerfectBase-pairingtomRNAAAAAAAmRNACleavageandDestruction21dsRNADicerRISC

(RNAinducedsilencingcomplexes)

RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體1、化學(xué)合成2、體外轉(zhuǎn)錄3、長片斷dsRNAs經(jīng)RNaseIII類降解(e.g.Dicer,E.coli,RNaseIII)4、PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)5、siRNA表達(dá)質(zhì)粒載體或者病毒載體在細(xì)胞中表達(dá)siRNAs八、SmallInhibitingRNA(siRNA)的制備(A)LongdsRNA(B)SyntheticsiRNA(D)Plasmid-basedshRNAvector(E)Virus-basedshRNAvector(C)DicedsiRNADicerMicroinjectionDicershRNAsiRNADicerTransfectionTransfectionTransfectionpolIIIpromotersensesenseTTTTspacer19-29nt3-9nt19-29ntshRNA3'U(1-5)5'CYTOPLASMsiRNAproducedinvitroDNABased,siRNAproducedinvivo基因芯片蛋白質(zhì)芯片微縮實(shí)驗(yàn)室（Lab-on-chip）芯片實(shí)驗(yàn)室是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)生物分析儀器的微型化大規(guī)模平行分析細(xì)胞破碎、蛋白質(zhì)電泳、過濾、DNA提取樣品制備芯片PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測生化反應(yīng)芯片檢測芯片基因芯片（genechip）或DNA芯片（DNAchip）實(shí)質(zhì)上是在固體支持物上高密度排列的DNA片段或寡核酸，所以又稱DNA微陣列（DNAarray）或寡核苷酸微陣列（oligonuleotidearray）?；蛐酒睦碚摶A(chǔ)：傳統(tǒng)的Southernblot和Northernblot是將受檢測的樣本固定在尼龍膜上，再利用特定的已知探針來檢測樣本中是否存在互補(bǔ)的DNA序列?；蛐酒暮诵脑砼cSouthernblot和Northernblot相同，只是相反將各種探針固化到基質(zhì)上，用以檢測受檢樣品中與各種探針互補(bǔ)的核酸物質(zhì)的變化。1樣品制備2DNA提取3熒光標(biāo)記4分子雜交5信號(hào)檢測6點(diǎn)陣分析DNA芯片的主要類型按制備方式分：原位合成芯片：采用顯微光蝕刻等技術(shù)在特定部位原位合成寡核苷酸而制備的芯片。探針較短DNA微集陣列：將預(yù)先制備的DNA片段以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。探針的來源較靈活DNA芯片樣品制備系統(tǒng)DNA樣品的提取純化DNA樣品的PCR擴(kuò)增探針的合成與標(biāo)記等DNA點(diǎn)陣芯片的制作工藝主要分為兩大類：（1）在芯片點(diǎn)陣上直接合成寡核苷酸如Affymetrix公司利用半導(dǎo)體工業(yè)中的光版印刷技術(shù)定位曝光點(diǎn)陣，在使用固相光化學(xué)合成法，并行合成高密度的寡核苷酸點(diǎn)陣。（2）用點(diǎn)樣的方式生成用點(diǎn)陣式或噴墨式印刷法將納升級(jí)的微量DNA溶液直接以陣列形式點(diǎn)放并固化在芯片載體上以制備DNA點(diǎn)陣芯片。

DNA芯片制備系統(tǒng)固相光化學(xué)合成用點(diǎn)樣的方式生成玻璃基質(zhì)基因芯片微點(diǎn)陣制備系統(tǒng)光版印刷分割封裝芯片成品基因芯片自動(dòng)雜交儀分子雜交系統(tǒng)基因芯片熒光偵測儀高密度微點(diǎn)陣檢測掃描系統(tǒng)高密度微點(diǎn)陣分析軟件圖象分析系統(tǒng)世界著名商業(yè)雜志《財(cái)富》對基因生物芯片領(lǐng)域非?？春?，它在其1997年的3月31刊中講到：“微處理器使我們的經(jīng)濟(jì)發(fā)生了根本改變、給人類帶來了巨大的財(cái)富、改變了我們的生活方式。然而，生物芯片給人類帶來的影響可能會(huì)更大…...”噴墨打印技術(shù)

DNA測序:雜交測序（SBH）基因表達(dá)分析：基因組研究：作圖、測序、基因鑒定、基因功能分析基因診斷：尋找和檢測與疾病相關(guān)的基因及在RNA水平上檢測致病基因的表達(dá)藥物研究與開發(fā)：cDNAmicroarrayexpressionpatternsofsmall(S)andlarge(L)神經(jīng)元基因表達(dá)譜（geneexpressionpattern)BiologicalSampleFunctionalInformation紅色上調(diào)黃色不變綠色下調(diào)基因表達(dá)譜芯片的應(yīng)用最為廣泛，技術(shù)上也最成熟。這種芯片可以檢測整個(gè)基因組范圍的眾多基因在mRNA表達(dá)水平的變化。它能對來源于不同個(gè)體、不同組織、不同細(xì)胞周期、不同發(fā)育階段、不同分化階段、不同生理病理、不同刺激條件下的組織細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)情況進(jìn)行對比分析。從而對基因群在個(gè)體特異性、組織特異性、發(fā)育特異性、分化特異性、疾病特異性、刺激特異性的變化特征和規(guī)律進(jìn)行描述，進(jìn)一步闡明基因的相互協(xié)同、抑制、互為因果等關(guān)系。有助于理解基因及其編碼的蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，并從已知生物學(xué)功能的基因推論未報(bào)道基因的生物學(xué)意義。同時(shí)，還可在基因水平上解釋疾病的發(fā)病機(jī)理，為疾病診斷、藥效跟蹤、用藥選擇等提供有效手段。例如：急性白血病、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等表達(dá)譜芯片的研究。基因芯片的優(yōu)點(diǎn)高通量大規(guī)模高度平行性快速高效高靈敏度高度自動(dòng)化第三節(jié)基因信息分析技術(shù)基因信息分析是基因工程實(shí)驗(yàn)必不可少的部分?；蛐畔⒎治龅膬?nèi)容核酸蛋白質(zhì)序列的檢索核酸序列的分子量、堿基組成、堿基分布序列變換限制性酶切分析克隆測序結(jié)果分析基因的電子表達(dá)譜分析核酸序列的電子基因定位分析核酸蛋白質(zhì)序列比對分析cDNA序列的開放讀碼框分析引物設(shè)計(jì)一、核酸序列的檢索對已知核酸序列的檢索是核酸序列分析的一個(gè)基本方面。常用的方法有兩種:第一種方法:利用美國國家生物信息中心（NCBI）的Entrez檢索系統(tǒng)(.html)進(jìn)行檢索。第二種方法:使用SRS檢索系統(tǒng)（SequenceRetrievalSystem）。SRS是歐洲生物信息研究所（EBI）開發(fā)的以WWW界面運(yùn)行的數(shù)據(jù)庫檢索系統(tǒng)，是生物信息界應(yīng)用最為廣泛的數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，目前在全球有40多個(gè)SRS服務(wù)器（），中國有5個(gè)Entrez的核酸序列檢索界面對多個(gè)序列接受號(hào)進(jìn)行批量檢索，可在序列輸入框中輸入多個(gè)序列接受號(hào)，之間以空格分開。SRS的詳細(xì)使用方法可參見用戶使用手冊和SRS教程（）（）。中國主要的SRS服務(wù)器機(jī)構(gòu)數(shù)據(jù)庫數(shù)目網(wǎng)址SRS版本號(hào)

北京大學(xué)（PKU）138

7.0.2

中南大學(xué)（SCUT）26

:9090/srs71/

7.1.3中國微生物信息網(wǎng)（IM）647.1.1中國生物信息網(wǎng)（BioSino）15/srs71/7.1上海生物信息技術(shù)研究中心827.1（SCBIT）二、核酸序列的基本分析（一）分子量、堿基組成、堿基分布（二）序列變換（三）限制性酶切分析（四）克隆測序結(jié)果分析（一）分子量、堿基組成、堿基分布核酸序列的分子量、堿基組成、堿基分布等分析可通過一些常用軟件，如BioEdit、DNAMAN等進(jìn)行。（二）序列變換進(jìn)行序列分析時(shí)，經(jīng)常需要對核酸序列進(jìn)行各種變換，例如反向序列、互補(bǔ)序列、互補(bǔ)反向序列、顯示DNA雙鏈、轉(zhuǎn)換為RNA序列等。使用BioEdit或DNAMAN等軟件可以容易地實(shí)現(xiàn)這些功能。在BioEdit中，這些功能集中在“Sequence”→“NucleicAcid”，從中可以選擇對當(dāng)前序列進(jìn)行不同方式的序列變換。（三）限制性酶切分析限制酶數(shù)據(jù)庫（RestrictionEnzymeDatabase,REBASE）中收集了限制酶的所有信息，包括甲基化酶、相應(yīng)的微生物來源、識(shí)別序列位點(diǎn)、裂解位點(diǎn)、甲基化特異性、酶的商業(yè)來源以及分開發(fā)表和未發(fā)表的參考文獻(xiàn)（.com/rebase/rebase.html）。1、限制酶數(shù)據(jù)庫2、限制酶分析軟件①利用REBASE在線工具利用REBASE在線工具對SARSCoV完成基因組（GenBank接受號(hào)NC_004718）進(jìn)行的限制性酶切分析，顯示限制酶名稱和虛擬凝膠電泳結(jié)果。②BioEdit軟件BioEdit軟件通過“Sequence”→“NuclearAcid”→“RestrictionMap”即可完成限制性酶切分析。（四）克隆測序結(jié)果分析1.測序峰圖的查看使用BioEdit和DNAMAN軟件可實(shí)現(xiàn)這一功能。BioEdit可直接打開測序結(jié)果文件進(jìn)行觀看。并將序列以文本或fasta格式輸出2.核酸測序中載體序列的識(shí)別與去除在對測序結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析之前，必須將載體序列去除。使用NCBI的VecScreen系統(tǒng)（）可確定載體序列。下圖顯示使用VecScreen對一條長為688bp的序列進(jìn)行識(shí)別的結(jié)果，從圖中可看出，第137~688位之間是非載體序列部分。三、基因的電子表達(dá)譜分析對未知新基因的組織表達(dá)譜的研究能夠?yàn)樵摶虻墓δ苎芯刻峁┲匾獏⒖夹畔??；虻碾娮颖磉_(dá)譜分析原理是，將待分析的序列與EST序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，根據(jù)與待分析核酸序列具有高相似性的EST序列所對應(yīng)的組織來源推斷出該基因的組織表達(dá)譜。

利用NCBI的UniGene數(shù)據(jù)庫可進(jìn)行電子表達(dá)譜分析（）將待分析的序列利用Blastn程序進(jìn)行序列同源性搜索，一般情況下可以從EST數(shù)據(jù)庫中搜索到一批與待分析序列高度相似的EST序列。選擇相似性打分最高的一條EST序列，檢索UniGene數(shù)據(jù)庫，得到相應(yīng)的UniGene編號(hào)，之后就可通過參與形成UniGeneCluster的序列的組織/細(xì)胞來源間接地推斷出待分析序列在何種組織中表達(dá)。EXPRESSIONINFORMATIONNote:Highlyrepresented(2.0pct)inlibrary8417GN0250Note:Highlyrepresented(1.2pct)inlibrary5944UT0038cDNAsources:colon;adenocarcinoma;maxilla,pooled;HumanPlacenta;NEUROBLASTOMACOT25-NORMALIZED;NEUROBLASTOMACOT10-NORMALIZED;WhiteMatter;totalbrain;lacrimalgland(淚腺);liver;breast;lymphoma(n.[醫(yī)]淋巴瘤),follicularmixedsmallandlargecell;head_neck;PLACENTA(n.胎盤,胎座)COT25-NORMALIZED;pooledgermcelltumors(胚細(xì)胞腫瘤,胚細(xì)胞瘤);Testis;thymus(n.胸腺),pooled;normalnasopharynx;CNCAP(3)T-225cellline;stomach;leiomyosarcoma;placenta;kidney;correspondingnoncancerouslivertissue;amnion_normal;testis_normal;pituitary利用UniGene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因的電子表達(dá)譜分析結(jié)果示例四、核酸序列的電子基因定位分析對核酸序列進(jìn)行電子基因定位（即基因的染色體定位），通過所定位區(qū)帶的相鄰基因或基因簇間接地提示該基因的功能，是核酸序列分析的一個(gè)重要方面。（一）利用STS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子基因定位序列標(biāo)簽位點(diǎn)（sequencetaggedsite,STS）是指染色體定位明確，并且可用PCR擴(kuò)增的單拷貝核酸序列。dbSTS為GenBank的一個(gè)子庫，所有序列標(biāo)簽位點(diǎn)的序列都保存在這個(gè)數(shù)據(jù)庫中。自2001年3月19日，UniSTS（）取代dbSTS提供STS信息。利用STS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子基因定位時(shí)，主要利用NCBI的電子PCR資源。如果已知序列的接受號(hào)，可直接利用接受號(hào)對UniSTS進(jìn)行檢索也可直接利用電子PCR資源（），將序列提交（二）利用UniGene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子基因定位獲得待分析序列所對應(yīng)的UniGene編號(hào)后，通過檢索UniGene數(shù)據(jù)庫，從定位信息便可得知待分析序列的基因定位。（三）直接利用基因組序列進(jìn)行電子基因定位將待分析的序列對NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，有可能直接獲得待分析序列所對應(yīng)的基因組序列，一步實(shí)現(xiàn)基因定位。一般方法如下：1.將待分析的序列對NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索；2.得到確定的基因定位后點(diǎn)擊“L”按鈕，觀察基因在染色體上的位置。3.點(diǎn)擊“Position”所對應(yīng)的鏈接，瀏覽器中將顯示詳細(xì)的基因定位結(jié)果。五、基于核酸序列比對分析的功能預(yù)測（一）基于NCBI/Blast軟件的核酸序列同源性分析對核酸序列的首要分析是進(jìn)行序列的同源性搜索，以便利用最新的數(shù)據(jù)庫資源，確定待分析的序列是否為已知序列，以及它與已知序列相似性的高低。典型的分析是采用NCBI/Blast程序?qū)enBank中的非冗余數(shù)據(jù)庫（non-redundantdatabase,nr）進(jìn)行搜索（）Blast程序包括：（1）blastn，用核酸序列檢索核酸序列數(shù)據(jù)庫；（2）blastp，用蛋白序列檢索蛋白序列數(shù)據(jù)庫；（3）blastx，用核酸序列檢索蛋白序列數(shù)據(jù)庫（基于核酸序列所有可能的6個(gè)不同的讀碼框）；（4）tblastn，用蛋白序列檢索核酸序列數(shù)據(jù)庫（基于核酸序列所有可能的6個(gè)不同的讀碼框）；（5）tblastx，用核酸序列檢索核酸序列（表達(dá)）數(shù)據(jù)庫（基