自然殺傷細胞（Naturalkillercell,NK）金伯泉第四軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室自然殺傷細胞專家講座第1頁

NK細胞研究歷史

NK細胞發(fā)育分化

NK細胞受體分類

NK細胞受體識別配體

NK細胞其它膜分子及其識別配體

NK細胞生物學(xué)活性

NK細胞亞群

NK細胞與臨床自然殺傷細胞專家講座第2頁

70年代初抗腫瘤研究中發(fā)覺，無需Ab存在和預(yù)先致敏條件下即可殺傷腫瘤細胞淋巴細胞

大顆粒淋巴細胞（LGL）

參加固有免疫（innateimmunity）

怎樣區(qū)分“本身”和“非己”？?早期研究NK細胞研究歷史自然殺傷細胞專家講座第3頁自然殺傷細胞專家講座第4頁自然殺傷細胞專家講座第5頁

90年代初提出“失去自己（missingself）”假設(shè)

發(fā)覺NK細胞受體（種類繁多，活化型或抑制型）

判定出一批NK細胞受體識別配體

NK細胞表面標志（CD分子和黏附分子等）

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、功效及臨床研究深入90年代有主要突破自然殺傷細胞專家講座第6頁

發(fā)育分化場所：主要在骨髓和胸腺

主要細胞因子：SCF、flt3L、IL-7、IL-15（分化）

IL-12、IL-18、IL-2（刺激）

分布：脾（3~4%）、PBMC（6~15%）、

BM淋巴細胞（1%）、肝臟、肺臟

NK細胞取得免疫耐受

抑制性受體表示

假說：“最少有一個抑制性受體模型”NK細胞發(fā)育和分化自然殺傷細胞專家講座第7頁依據(jù)NatureReviewsImmunol,;7:703修改胸腺ELPNKPiNKmNK骨髓HSCNKPiNKmNKNKPiNKmNK外周淋巴器官肝臟NKPiNKmNKNK細胞發(fā)育路徑ELP：早期淋巴樣前體細胞；NKP：NK細胞前體iNK：非成熟NK細胞；mNK：成熟NK細胞自然殺傷細胞專家講座第8頁LinCD122+

CD34+/CD34IL15R+

CD122CD161CD117（KIT）細胞因子在NK細胞分化中作用NK祖細胞

CD122+CD16+/CD16CD56+CD161+IL12、IL18IL15flt3LSCF,IL7IL15IL15NK前體細胞成熟NK細胞(I)成熟NK細胞(II)IL2自然殺傷細胞專家講座第9頁按其配體是否為MHCI類分子識別MHCI類(Ia或Ib)分子受體識別非MHCI類分子受體

按受體胞膜外區(qū)結(jié)構(gòu)：IgSF和CL-SF

按其基因定位分為不一樣家族

KIR、ILT/LIR、CD94/NKG2、Ly49

和NKR-P1家族以及NCR家族

按功效：抑制型受體和活化型受體NK細胞受體分類自然殺傷細胞專家講座第10頁KIR家族(killerimmunoglubulin-likereceptor)IgSFILT/LIR家族(immunoglubulin-liketranscript/leukocyteimmunoglubulin-likereceptor)

IgSF

CD94/NKG2家族

CL-SFLy49家族CL-SFNKR-P1家族CL-SF

NCR家族(naturalcytotoxicityreceptor)IgSF

按受體基因定位分為不一樣家族自然殺傷細胞專家講座第11頁NK基因復(fù)合體NKRP1CD69CD94NKG2Ly49小鼠6號染色體NKRP1ACD69CD94NKG2Ly49L人12號染色體1a1c1d1fdecadfeca自然殺傷細胞專家講座第12頁(n=1~14)(n=1~10)(n=1~7)(n=1~7)(n=1~10)HumanChr.19qDAP12DAP10CD66NKG7ILTsLAIRsILTsKIRsFcRNKp46GPVIMouseChr.7DAP12DAP10/KAP10CD66NKG7PIRsNKp46GPVI白細胞受體復(fù)合體(LRC)組成LRC:leukocytereceptorcomplex自然殺傷細胞專家講座第13頁KIR分子結(jié)構(gòu)D2D2D1D0ITIMsITAM2DL2DS2DL43DL3DSSSD1D2D1D2D0

SSKKSSSSSSSSSSSSSSD2D1D0

SSSSSS自然殺傷細胞專家講座第14頁亞家族及成員其它命名反應(yīng)mAb胞膜外區(qū)Ig樣區(qū)跨膜區(qū)帶電荷氨基酸胞漿區(qū)結(jié)合HLA特異性傳遞信號性質(zhì)氨基酸數(shù)ITIM數(shù)KIR2DKIR2DL(L1-L4)KIR2DL1p58.1,CD158aEB6HP3E4D1+D2842HLAC1組抑制性KIR2DL2/L3p58.2,CD158b1/b2GL183DX27,CHLD1+D2842HLAC2組抑制性KIR2DL4CD158dD0+D21141HLAG等抑制性KIR2D5CD158fKIR2DS(S1-S6)KIR2DS1p50.1,CD158hEB6HP3E4D1+D2賴氨酸,結(jié)合DAP12

390HLAC1組活化性KIR2DS2p50.2,CD158jGL183DX27,CHLD1+D2賴氨酸,結(jié)合DAP12390HLAC2組活化性KIR2DS3D1+D2賴氨酸,結(jié)合DAP12390HLAC組活化性KIR2DS4CD158iKIR2DS5CD158gKIR2DS6CD158cKIR家族組員和結(jié)構(gòu)自然殺傷細胞專家講座第15頁KIR家族組員和結(jié)構(gòu)亞家族及成員其它命名反應(yīng)mAb胞膜外區(qū)Ig樣區(qū)跨膜區(qū)帶電荷氨基酸胞漿區(qū)結(jié)合HLA特異性傳遞信號性質(zhì)氨基酸數(shù)ITIM數(shù)KIR3DKIR3DL(L1,L2,L7)KIR3DL1P70CD158e1DX9Z27D0+D1+D2842HLABw4抑制性KIR3DL2p140CD158kNKAT45.133Q66D0+D1+D2

(二聚體)952HLAA3,A11抑制性?KIR3DL7CD158z抑制性KIR3DS1p70CD158e2D0+D1+D2賴氨酸,結(jié)合DAP12270自然殺傷細胞專家講座第16頁C2ssILT2ILT5ILT3ILT1ILT7ILT8LIR6aILT11ILT6

R+DDFcRSSITIMITAMC2ssC2ssC2ssC2ssC2ssC2ssC2ssC2ssC2ssC2ssC2ssC2ssC2ssC2ssC2ssC2ssC2ssC2ssC2ssC2ssC2ssLIR8ILT4ILT/LIR家族組成和分子結(jié)構(gòu)抑制型受體活化型受體可溶型受體自然殺傷細胞專家講座第17頁C2ssC2ss-SS-SSVssSS-Vss-SSDAP-2SS

NKp46NKp30NKp44(CD335)(CD337)(CD336)ITAMNCR分子結(jié)構(gòu)及其膜相關(guān)分子自然殺傷細胞專家講座第18頁CD94/NKG2分子結(jié)構(gòu)SSITIMITAMDAP12ITAMDAP10/DAP12抑制性受體活化性受體活化性受體SSSSCD94NKG2A(CD159a)CD94NKG2C(CD159c)NKG2D(CD314)

(同源二聚體)自然殺傷細胞專家講座第19頁Ly49分子結(jié)構(gòu)

Ly-49A,B,C,E,F,G,ILy-49D,HITIMITAMDAP12抑制性受體活化性受體SSSS自然殺傷細胞專家講座第20頁NKR-P1分子結(jié)構(gòu)NKR-P1BNKR-P1C(NK1.1/CD161c)ITIMITAM-SSSS自然殺傷細胞專家講座第21頁NK1.1/CD161c單抗在研究中應(yīng)用

是小鼠NK細胞標志體內(nèi)注射NK1.1mAb是去除小鼠體內(nèi)NK細胞方法

NK1.1+CD3+為小鼠NKT細胞標志自然殺傷細胞專家講座第22頁NKNKP815P815促進殺傷抑制殺傷活化型受體抑制型受體重導(dǎo)向殺傷試驗確定NK活化型/抑制型受體

自然殺傷細胞專家講座第23頁受體家族識別配體KIR家族HLAIa(A,B,C);HLAIb(G)LIR家族HLAI,HLA-GNCR家族HA,B7-H6,BTA-3CD49/NKG2家族HLA-ENKG2DULBP,MICA/BLy49家族H-2I類分子NKR-P1家族LLT1,CIr-BNK細胞受體識別配體自然殺傷細胞專家講座第24頁非經(jīng)典MHCⅠ類分子HLA-E、HLA-F、HLA-G自然殺傷細胞專家講座第25頁KIR識別經(jīng)典MHCI類分子特異性

KIR2DL1KIR2DL2

KIR3DL1KIR3DL2NKAT4

KIR2DL4HLAC(第一組)

HLAC(第二組）

：ITIM：本身或外來肽段HLABw4(7783aa)HLAA3、A11HLAG和其它NK細胞APC/靶細胞：經(jīng)典HLAI類分子或HLAG分子自然殺傷細胞專家講座第26頁ssssLy49家族識別H-2I類分子H-2Ⅰ類分子Ly49自然殺傷細胞專家講座第27頁NKp46

血凝素(HA)(如流感病毒)NKp44HA(如流感病毒),BCGNKp30BAT3(HLA-B

associatedtranscript3)

B7-H6

HLA-B相關(guān)轉(zhuǎn)錄物3(BAT3)由腫瘤細胞所釋放,B7-H6表示于腫瘤細胞NCR配體自然殺傷細胞專家講座第28頁配體為凝集素分子

小鼠抑制性受體NKR-P1B配體

C型凝集素相關(guān)b(Ctypelectin-relatedb,Clr-B)，同源二聚體，編碼基因定位于NK基因復(fù)合體，腫瘤細胞表示Clr-B水平與對殺傷敏感性相關(guān)

人抑制性受體NKR-P1A配體凝集素樣轉(zhuǎn)錄物1(lectin-liketranscript1,LLT1)，與人NKR-P1A結(jié)合后抑制NK細胞細胞毒和IFN-分泌。膠質(zhì)瘤細胞高表示LLT1，與腫瘤免疫逃逸相關(guān)自然殺傷細胞專家講座第29頁配體為非經(jīng)典MHCI類分子(MHCⅠb)

HLA-E

結(jié)構(gòu)：同經(jīng)典HLA-I類分子相同，如與2m組成復(fù)合體，結(jié)合9肽（主要來自HLA-I類和HLA-G重鏈先導(dǎo)序列3-11位aa）

對應(yīng)受體：CD94/NKG2

調(diào)整NK活性：CD94/NKG2A抑制性（為主）

CD94/NKG2C刺激性胎盤滋養(yǎng)層表示HLA-E，抑制母體蛻膜中CD94/NKG2A+NK殺傷作用，維持胎盤免疫耐受;腫瘤細胞丟失HLA-I類分子和上調(diào)HLA-E分子，分別逃逸CTL和NK兩種細胞殺傷自然殺傷細胞專家講座第30頁配體為非經(jīng)典MHCI類分子(MHCⅠb)

HLA-G

結(jié)構(gòu)：同經(jīng)典HLA-I類分子相同，結(jié)合9肽

對應(yīng)配體：ILT2、ILT4、KIR2DL4

表示：高表示于胎盤外絨毛細胞滋養(yǎng)層

作用：抵抗NK細胞殺傷，維持胎盤免疫特免作用；黑素瘤可高表示HLA-G，抑制NK殺傷自然殺傷細胞專家講座第31頁與含有ITAM膜相關(guān)分子相連NK細胞受體膜相關(guān)分子ITAM基序數(shù)相連NK細胞受體3/3CD16、NKp46、NKp303/1CD16、NKp461/1CD16、ILT1、ILT1樣蛋白、ILT7ILT8、LIR6a、NKRP1C(CD161c)DAP12(同源二聚體)1/1KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3KIR3DS、NKp44、CD94/NKG2C、ELy49D、Ly49HDAP10(同源二聚體)1/1NKG2D自然殺傷細胞專家講座第32頁含有ITAM模體NK活化型受體示意圖自然殺傷細胞專家講座第33頁MHC/肽，IgG，Ag免疫受體ITAM

PLCγ活化，磷酸化配體結(jié)合對應(yīng)受體

MHCI/肽免疫受體——[DAG→IP3→激活Src家族PTK募集和活化含SH2-信號分子活化轉(zhuǎn)錄因子免疫活化FynLckLynZAP70PIP2PKCCa2+ITIMSHP-1(SHP-2)使CD3ζ、ZAPPLCγ去磷酸化免疫抑制磷酸化或去磷酸化ITAM、ITIM免疫受體與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系自然殺傷細胞專家講座第34頁NK細胞其它膜分子及其參加NK細胞功效

種類和成員參與NK功能CD16(FcRIIIA)活化NK,ADCCCD160(BY55)協(xié)同受體CD2(LFA2)活化性受體,黏附內(nèi)皮細胞,穿越血管,局部浸潤CD226(PTA1/DNAM1)活化性受體CD96活化NK表示水平顯著增加PECAM1(CD31)黏附內(nèi)皮細胞CD56不清CD223(LAG3)活化NK細胞CD244(2B4)MHC非限制性殺傷,活化性受體LAIR1(9.1C3)抑制性受體自然殺傷細胞專家講座第35頁

NK細胞其它膜分子及其參加NK細胞功效種類和成員參與NK功能整合素家族VLA16(1)促進NK殺傷功效,黏附內(nèi)皮細胞,穿越血管,局部浸潤LFA-1(CD11a/CD18,2)黏附內(nèi)皮細胞,遷移到淋巴結(jié)和組織4/7沿血管滾動選凝素CD62L穿越內(nèi)皮細胞到組織C型凝集素樣超家族CD69活化NK細胞碳水化合物CD57CD15s沿血管滾動CD162R(PEN5)結(jié)合Lselectin,黏附和遷移Link結(jié)構(gòu)CD44穿越血管和局部浸潤自然殺傷細胞專家講座第36頁LAIR-1andLAIR-2結(jié)構(gòu)示意圖PredictedO-linkedglycosylationsitevSSvSSLAIR-1(CD305)LAIR-2(CD306)自然殺傷細胞專家講座第37頁參加NK細胞識別靶細胞黏附分子NK細胞膜分子靶細胞上對應(yīng)配體IgSFCD2LFA3CD16結(jié)合靶細胞上IgGPTA1CD155,CD112CD96CD155CD160(BY55)HLA-C整合素LFA1ICAM1,2Mac1,p150,95ICAM1,2CD44HA,FN,MAdCAM1自然殺傷細胞專家講座第38頁NK細胞參加黏附、穿越內(nèi)皮細胞膜分子作用時相NK細胞膜分子配體滾動Lselectin(CD62L)sLeX(CD15s)4/7CD57sLeX(CD15s)Eselectin(CD62E),Pselectin(CD62P)VCAM1(CD106),MAdCAM1,FNPselectin,Lselectin(CD62L),LN黏附內(nèi)皮細胞LFA1(CD11a/CD18)VLA4(4/1)LFA2(CD2)PECAM1(CD31)ICAM1(CD54),ICAM2(CD102)VCAM1,FNLFA3(CD58)PECAM1穿越血管和浸潤VLA1(1/1)VLA2(2/1)VLA4(4/1)VLA5(5/1)VLA6(6/1)CD44LFA2CO,LNCO,LNFNFNLNHA,FN,COLFA3自然殺傷細胞專家講座第39頁其它NK細胞膜分子識別配體

NK細胞膜分子結(jié)構(gòu)特征相應(yīng)配體NKRP1A(大鼠)NKD各種碳水化合物CD69NKD不清CD2(LFA2)IgSFLFA3CD16(FcRIIIA)IgSFIgGFc段CD56(NCAM)IgSFCD56CD96(Tactile)IgSFCD155CD226(PTA1/DNAX1)IgSFCD155,CD112NKp46、NKp30、NKp44IgSFHA,BCG,BAT3CD244(2B4)IgSFCD48CD223(LAG3)IgSFMHCII類分子CD57寡糖Lselectin,Pseletin、LNCD162R碳水化合物L(fēng)selectinCD305(LAIR-1)IgSF膠原自然殺傷細胞專家講座第40頁NATUREIMMUNOLOGYVOLUME9NUMBER5MAY自然殺傷細胞專家講座第41頁

細胞毒

方式：自然殺傷和ADCC

路徑：脫顆粒路徑(穿孔素、粒酶B)和凋亡誘導(dǎo)配體路徑(Fas/FasL、TRAIL/DR4DR5和TNF/TNFR)

合成和分泌細胞因子發(fā)揮免疫效應(yīng)和免疫調(diào)整功效：

IFN-：活化M，誘導(dǎo)Th0Th1，Ig類別轉(zhuǎn)換

TNF：直接殺傷靶細胞和免疫調(diào)整作用

GM-CSF、M-CSF：可能參加造血調(diào)控

IL-10和TGF-：免疫負調(diào)整

抗原提呈功效：活化NK細胞(NKp44+MHCⅡ+CD86+)

含有抗原提呈功效,細胞毒活性和細胞因子產(chǎn)生能力也顯著升高NK細胞生物學(xué)活性自然殺傷細胞專家講座第42頁穿孔素/顆粒酶路徑顆粒Fas/FasL路徑顆粒酶穿孔素穿孔素形成孔洞顆粒酶Caspase級聯(lián)反應(yīng)凋亡細胞毒作用靶細胞NK自然殺傷細胞專家講座第43頁數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生，數(shù)小時后靶細胞被殺傷?？焖龠B續(xù)殺傷多個靶細胞，本身保持完好。高效定向只殺傷靶細胞，而不殺傷鄰近正常細胞。自然殺傷細胞專家講座第44頁合成和分泌細胞因子自然殺傷細胞專家講座第45頁NK細胞參加抗感染作用機制IgG2aIg類轉(zhuǎn)換

ADCCIFNIL-12殺傷穿孔素殺傷

NOIFNIFNIL-12IL-15IL-18IFN/IFNBNK活化M/DC靶細胞Th2Th1TNF-M/DC自然殺傷細胞專家講座第46頁NK(人)免疫耐受“missing-self”免疫逃逸免疫耐受免疫逃逸

配體表示配體不表示黑素瘤細胞配體表示膠質(zhì)瘤細胞高表示HLA-G高表示LLT-1(HLA-A、B、C)或GMHCIaLLT-1NKR-P1ACD94/NKG2AILT2KIRMHCIa(HLA-A或B)MHCIb(HLA-E)非成熟DC不表示HLA-E,易被NK細胞殺傷DC“質(zhì)量控制”滋養(yǎng)層細胞表示HLA-E,抑制NK細胞功效胎盤免疫耐受HCMV編碼UL-18結(jié)合ILT2,抑制宿主NK細胞殺傷病毒感染細胞人NK細胞抑制型受體與對應(yīng)配體結(jié)合參加免疫調(diào)整自然殺傷細胞專家講座第47頁小鼠NK細胞抑制型受體與對應(yīng)配體結(jié)合參加免疫調(diào)整NK(小鼠)免疫耐受“missing-self”增加腫瘤細胞對NK殺傷敏感性

配體表示配體不表示配體表示下調(diào)(H-2D、K、L)MHCIaClr-bNKR-P1BCD94/NKG2AMHCIb(Qa-1)Ly49自然殺傷細胞專家講座第48頁NKp46/p30/p44殺傷靶細胞示意圖

抑制性受體NCRMHCⅠ靶細胞—+不殺傷NK自然殺傷細胞專家講座第49頁NKp46/p30/p44殺傷靶細胞示意圖

抑制性受體NCRMHCⅠ靶細胞—+殺傷NK自然殺傷細胞專家講座第50頁KIR

HLAⅠ殺傷NCR

NKG2D

CD226

MICA/BULBPsBAT3CD155/CD122

NK細胞受體腫瘤細胞配體

NK細胞抑制型和殺傷型受體平衡決定NK細胞殺傷腫瘤細胞活性B7-H6自然殺傷細胞專家講座第51頁不能殺傷

NK細胞抑制型和殺傷型受體平衡決定NK細胞殺傷腫瘤細胞活性KIR

HLAⅠNCR

NKG2D

CD226

MICA/BULBPsBAT3CD155/CD122

NK細胞受體腫瘤細胞配體自然殺傷細胞專家講座第52頁敏感靶細胞不敏感靶細胞人K562髓樣白血病細胞DaudiBurkitt淋巴瘤Molt-4急性T淋巴細胞白血病細胞RajiBurkitt淋巴瘤JM急性T淋巴細胞白血病細胞LiBr黑色素瘤細胞Jurkat急性T淋巴細胞白血病細胞U-937前單核細胞一些新鮮腫瘤細胞小鼠Moloney病毒誘導(dǎo)T淋巴瘤Yac-1Benzpyrene誘導(dǎo)胸腺(A/Sn小鼠)淋巴瘤EL-4(C57BL/6)MPC-11礦物油誘導(dǎo)漿細胞瘤Methlycholanthrene誘導(dǎo)(BALB/c小鼠)肥大細胞瘤P815(DBA/2)X-63人和小鼠NK細胞敏感和不敏感靶細胞自然殺傷細胞專家講座第53頁CD56bri和CD56dimNK細胞亞群TRENDSinImmunology,22:11CD56+CD3+CD56dimCD3CD16briNK：高細胞毒活性NK亞群；CD56briCD3

CD16dimNK：分泌細胞因子NK亞群自然殺傷細胞專家講座第54頁CD56brightNK亞群/NK1CD56dimNK亞群/NK2生物學(xué)活性CD56Brightdim占NK細胞百分率~10%(妊娠婦女子宮中占多數(shù))~90%胞漿顆粒(粒酶B、穿孔素)少多天然殺傷活性++++ADCC++++體外增殖能力(IL-2和IL-15刺激)高低NK細胞受體CD16+/(“”占CD56brightNK細胞~50%~70%)++(ADCC+++),(>95%CD56dim)KIR+/++CD94/NKG2A(抑制型受體)++(大部分)+/NKRP1A++NKG2D(活化型受體)++細胞因子受體IL-2R(高親和力)+(對低濃度IL-2反應(yīng))IL-2R(中親和力)++IL-15R+c-kit(SCFR/CD117)+人NK細胞兩