親和層析法純化胰蛋白酶

第一部分試驗(yàn)內(nèi)容介紹親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第1頁

1內(nèi)容摘要親和層析包含了一整套復(fù)雜底物及其配體與生物大分子之間相互作用時所形成獨(dú)特生物學(xué)特征。在親和結(jié)合過程中包括到疏水力、靜電力、范德華力及空間阻力等原因影響。親和層析概念能夠了解為配基以共價鍵形式與水不溶性固體載體共價結(jié)合，形成含有高度專一性親和吸附劑。以該介質(zhì)為填料填充親和層析柱，從復(fù)雜混合物中有針對性分離某一個成份。親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第2頁本試驗(yàn)以親和層析方法分離純化豬胰蛋白酶為目標(biāo)，從豬胰臟提取液中分離純化胰蛋白酶，最終得到純度較高胰蛋白酶。圍繞親和層析試驗(yàn)所包括蛋白質(zhì)和酶基本性質(zhì)及相關(guān)技術(shù)進(jìn)行綜合訓(xùn)練。其中主要包含親和層析介質(zhì)配基制備，親和介質(zhì)合成，蛋白質(zhì)和酶分離純化，酶活性測定等內(nèi)容。經(jīng)過綜合訓(xùn)練，能夠系統(tǒng)掌握蛋白質(zhì)制備基本原理和操作，學(xué)習(xí)怎樣進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，掌握試驗(yàn)過程中關(guān)鍵步驟，對試驗(yàn)中出現(xiàn)問題進(jìn)行科學(xué)分析。使學(xué)生在學(xué)習(xí)試驗(yàn)技術(shù)同時，自覺培養(yǎng)分析問題和處理問題能力。親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第3頁2試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)方法掌握蛋白質(zhì)分離純化基本原理與操作技術(shù)掌握親和層析基本原理及親和介質(zhì)合成技術(shù)掌握胰蛋白酶活性及抑制活性測定原理和方法掌握消光系數(shù)法測定蛋白質(zhì)原理及計(jì)算方法親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第4頁1.

3試驗(yàn)流程

雞蛋清

Spharose4B

豬胰臟

↓↓↓提取↓活化

提取分離純化↓↓↓

純卵粘蛋白(CHOM)→←活化Spharose4B

胰蛋白酶原粗提液↓↓

偶聯(lián)

激活↓↓

CHOM-Spharose4B→←胰蛋白酶提取液↓

親和層析↓

酶促動力學(xué)

←

純胰蛋白酶→酶活性測定

↓

酶蛋白含量測定親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第5頁1.

4要求掌握技術(shù)柱層析技術(shù)SephadexG-25分子篩層析

DEAE-Cellulose離子交換層析CHOM–Sepharose4B親和層析蛋白質(zhì)提取技術(shù)

10%TCA提取雞卵粘蛋白

3.5%乙酸,pH3.0提取胰蛋白酶原

蛋白含量測定技術(shù)消光系數(shù)法測定胰蛋白酶含量消光系數(shù)法測定雞卵粘蛋白含量親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第6頁生物活性測定

胰蛋白酶比活性測定雞卵粘蛋白抑制活性測定

親和介質(zhì)合成技術(shù)載體-Sepharose4B前處理載體-Sepharose4B活化活化載體-Sepharose4B偶聯(lián)親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第7頁第二部分試驗(yàn)方法

試驗(yàn)一雞卵粘蛋白分離純化

1雞卵粘蛋白基本性質(zhì)1.1雞卵粘蛋白組成分子量:28000Da分子組成:四個分子量相近亞基組成糖蛋白糖基部分:D-甘露糖,D-半乳糖,葡萄糖胺,唾液酸親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第8頁1.2化學(xué)穩(wěn)定性耐熱:在80℃條件下,理化性質(zhì)不發(fā)生改變耐有機(jī)溶劑:在50%丙酮溶液中,能保持良好溶解度耐沉淀劑:在10%TCA溶液中不發(fā)生沉淀.1.3等電點(diǎn)性質(zhì)等電點(diǎn):pI在3.9-4.5之間溶液中狀態(tài):在pH3.0溶液中穩(wěn)定,在pH8.0溶液中輕易分解雞卵粘蛋白在10%TCA不一樣pH值溶液中溶解狀態(tài)見表1。親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第9頁表1，雞卵粘蛋白在10%TCA溶液中溶解度

溶液pH值雞卵粘蛋白

雞卵清蛋白

等于3.5沉淀5%溶解95%沉淀95%溶解5%低于3.5沉淀↑溶解↓沉淀↑溶解↓高于3.5沉淀↓溶解↑沉淀↓溶解↑

親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第10頁1.2.雞卵粘蛋白提取2.1提?。?/p>

每組發(fā)給50毫升雞卵清加入一定體積10%pH1.15TCA溶液(輕輕攪拌一邊攪拌一邊加入),攪勻后用pH試紙檢驗(yàn)pH值,待pH穩(wěn)定在3.5±0.2后放置4℃冰箱過夜.2.2離心：轉(zhuǎn)移50毫升離心杯中,于3000rpm離心15min。2.3過濾：傾出上清液，濾紙過濾，濾去上浮脂類物質(zhì)和不溶物2.4調(diào)pH值：用1mol/LHCl將溶液準(zhǔn)確調(diào)至pH3.5。量取體積。親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第11頁2.5丙酮沉淀：緩緩加入三倍體積預(yù)冷丙酮，攪勻，用塑料薄膜封嚴(yán)，放置冰箱內(nèi)靜止4小時。2.6離心：虹吸出部分上清，將沉淀部分轉(zhuǎn)移到50ml離心杯中，于3000rpm離心15min。2.7除殘留丙酮：棄去上清液，將盛有沉淀離心杯至于真空干燥器中。抽去殘留丙酮。（沉淀物顏色由白變成透明膠狀物即可）2.8溶解：加入25ml蒸餾水或20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液溶解，濾紙過濾，搜集濾液，備用。親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第12頁3雞卵粘蛋白分離純化3.1SephadexG-25柱脫鹽(1)溶脹：稱取15gSephadexG-25放入500ml燒杯中,加入200ml蒸餾水，在室溫下溶脹24小時或在沸水浴中溶脹2小時。(2)裝柱：取一支30×3cm層析柱，將溶脹好SephadexG-25裝柱，自然沉降。(3)處理：用2倍柱床體積0.5mol/LNaCl溶液洗柱，2倍體積蒸餾水洗去殘留NaCl。親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第13頁

(4)平衡：用20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液平衡，流速控制在1.0-1.5ml/min。紫外檢測儀檢測柱內(nèi)平衡狀態(tài)，直到儀器繪出穩(wěn)定基線。(5)上樣：將柱內(nèi)緩沖液液面流至于膠面相切，取20ml雞卵粘蛋白提取液上樣，待樣液液面流至于膠面相切，加入2-3ml緩沖液沖洗層析柱內(nèi)壁，待溶液液面流至于膠面相切，然后加入緩沖液距膠面高度約2-3cm，以一樣流速洗脫。(6)搜集：在檢測儀上觀察到開始出現(xiàn)峰時進(jìn)行搜集。見圖1親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第14頁圖1SephadexG-25分子篩層析分離圖譜親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第15頁3.2Cellulose離子交換柱層析分離(1)溶脹：稱取20gDEAE-Cellulose放入500ml燒杯中,加入150ml蒸餾水，在室溫下溶脹24小時。(2)裝柱：取一支20×3cm層析柱，將溶脹好DEAE-Cellulose裝柱，自然沉降。(3)再生：用200ml0.5mol/LNaCl–0.5mol/LNaOH混合溶液洗柱，再用蒸餾水洗至流出液pH值到達(dá)pH8.0。用200ml0.5mol/LHCl溶液洗柱，再用蒸餾水洗至流出液pH值到達(dá)pH6.0。親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第16頁(4)平衡：

用20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液平衡，流速控制在1.0ml/min。紫外檢測儀檢測柱內(nèi)平衡狀態(tài)，直到儀器繪出穩(wěn)定基線。(5)上樣：

將經(jīng)SephadexG-25柱脫鹽卵粘蛋白溶液上樣，用20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液平衡，直到儀器繪出穩(wěn)定基線。流速控制在1.0ml/min左右。(6)洗脫：

用0.3mol/LNaCl-20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液。(7)搜集：

在檢測儀上觀察到出現(xiàn)高峰時開始搜集。見圖2親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第17頁圖2，雞卵粘蛋白在DEAE-Cellulose柱分離親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第18頁3.3透析及丙酮沉淀(1)透析：將經(jīng)DEAE-Cellulose柱分離雞卵粘蛋白轉(zhuǎn)入透析袋內(nèi)，對蒸餾水透析，隔一段時間換一次水，直到滲出液經(jīng)BaCl2溶液檢驗(yàn)無氯離子存在，即可。(2)調(diào)pH值：將透析好雞卵粘蛋白溶液，用0.1mol/LHCl準(zhǔn)確調(diào)至pH4.0（最好一次調(diào)成功），量體積。(3)丙酮沉淀：加入3倍體積預(yù)冷丙酮，攪勻，用塑料薄膜封嚴(yán)，在冰箱內(nèi)靜止4小時以上或過夜。親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第19頁(4)離心：虹吸出部分上清，將沉淀部分轉(zhuǎn)移到50ml離心杯中，于3000rpm離心15min，搜集沉淀。(5)干燥：將盛有雞卵粘蛋白離心杯放入真空干燥器中干燥。(6)搜集雞卵粘蛋白成品，冰箱保留。親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第20頁4活性測定(1)標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶活性測定空白:1.5ml緩沖液→1.5ml底物混勻.樣品:1.5ml緩沖液→1.5ml底物→胰蛋白酶10μl混勻,馬上測定(2)自提雞卵粘蛋白抑制活性測定空白:1.5ml緩沖液→1.5ml底物混勻.樣品:1.5ml緩沖液→雞卵粘蛋白10μl→胰蛋白酶10μl混勻放置2min以上→1.5ml底物,馬上測定親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第21頁(3)雞卵粘蛋白含量測定取透析液0.3ml稀釋10倍,測定A280.3試驗(yàn)結(jié)果(1)計(jì)算雞卵粘蛋白收率(2)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶比活性(3)計(jì)算雞卵粘蛋白抑制活性。親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第22頁5試劑配制5.1公用試劑(1)10%TCA溶液,pH1.15,1500ml(50ml/組)(2)0.05mol/L,pH8.0Tris-HCl緩沖液,(內(nèi)含0.2%CaCl2)200ml(3)2mmol/LBAEE底物溶液200ml(4)1mg/LTrypsin標(biāo)準(zhǔn)溶液10ml

親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第23頁5.2自配試劑(1)0.2mol,pH6.6,PBS緩沖液120ml(×10)(2)0.3mol/LNaCl–0.02mol/L,pH6.6,PBS緩沖液100ml(3)0.5mol/LHCl溶液200ml(4)0.5mol/LNaCl–0.5mol/LNaOH溶液200ml(5)0.5mol/LNaCl溶液250ml親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第24頁6時間安排

星期早晨（8：00-12：00）下午（12：00-6：00）晚上一講試驗(yàn)，配試劑提取雞卵粘蛋白，裝DEAE和G25柱，處理各柱

二離心，丙酮沉淀，平衡G25柱和DEAE柱，離心，去丙酮上G25柱脫鹽，搜集第一峰，上DEAE柱分離，搜集第二峰，對蒸餾水透析過夜。

三換水，取樣測粘蛋白抑制活性和標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶活性，透析液調(diào)pH4，丙酮沉淀。繼續(xù)測定標(biāo)準(zhǔn)酶活性和抑制活性，離心，搜集沉淀物4℃干燥。結(jié)束試驗(yàn)

親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第25頁試驗(yàn)二親和層析純化胰蛋白酶親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第26頁1原理

雞卵粘蛋白(ovomucoid,簡稱CHOM)，是胰蛋白酶天然抑制劑，在pH7.8-8.0緩沖溶液中二者發(fā)生專一性親和作用。以雞卵粘蛋白為配基，偶聯(lián)在已經(jīng)活化瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)-Sepharose4B上，制備成雞卵粘蛋白親和層析介質(zhì)（CHOM-Sepharose4B）。然后經(jīng)過親和層析法從胰蛋白酶粗提液中分離純化胰蛋白酶。慣用載體活化與蛋配基偶聯(lián)方法有環(huán)氧氯丙烷活化和溴化氰活化法。反應(yīng)基本原理以下列圖所表示：親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第27頁1.1環(huán)氧氯丙烷活化載體與蛋白質(zhì)配基偶聯(lián)

↓活化

親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第28頁↓偶聯(lián)

↓親和結(jié)合

親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第29頁↓洗脫

親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第30頁1.2溴化氰活化載體

與蛋白質(zhì)配基偶聯(lián)

親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第31頁2親和介質(zhì)合成2.1瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)(Sepharose4B)活化2.1.1瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)處理稱取10克瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)，置于G-3玻璃燒結(jié)漏斗內(nèi)，用100ml1.0mol/LNaCl溶液抽洗（少許屢次），100ml蒸餾水抽洗，抽干后轉(zhuǎn)移到100ml三角瓶中備用。

親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第32頁2.1.2配方瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)--QT410克蒸餾水7ml1,4二氧六環(huán)8ml2mol/LNaOH6.5ml

環(huán)氧氯丙烷1.5ml。

親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第33頁2.1.3活化將配制好介質(zhì)三角瓶，放入45℃恒溫水浴中，于160轉(zhuǎn)/分鐘，振搖活化2小時。停頓活化，轉(zhuǎn)移到G-3玻璃燒結(jié)漏斗內(nèi)，抽去活化劑，用100ml蒸餾水洗（少許屢次），轉(zhuǎn)移100ml到三角瓶中，準(zhǔn)備偶聯(lián)。

親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第34頁2.2偶聯(lián)

稱取約100mg雞卵粘蛋白，用10ml0.1mol/LpH9.5Na2CO3緩沖液充分溶解。取0.1ml稀釋10倍測定OD280，計(jì)算溶液蛋白濃度。然后將溶解好雞卵粘蛋白溶液，轉(zhuǎn)移到100ml三角瓶中與活化瓊脂糖凝膠介質(zhì)混勻。在40℃恒溫水浴中，于160轉(zhuǎn)/分鐘，振搖偶聯(lián)22小時左右，停頓偶聯(lián)。

親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第35頁2.3洗滌取一個洗凈500ml抽濾瓶，將已經(jīng)偶聯(lián)好瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)轉(zhuǎn)移到G-3玻璃燒結(jié)漏斗內(nèi)抽濾，搜集濾液，測定濾液中剩下雞卵粘蛋白含量。用100ml1.0mol/LNaCl溶液抽洗，100ml蒸餾水抽洗，再用20ml親和層析洗脫液洗滌。

將親和介質(zhì)轉(zhuǎn)移到50ml小燒杯內(nèi)，加入20ml親和層析平衡液，浸泡20分鐘，脫氣，裝柱。

親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第36頁3胰蛋白酶粗提液制備3.1胰蛋白酶基本性質(zhì)3.1.1存在形式：胰蛋白酶通常是以胰酶原形式存在于動物胰臟或其它組織中。在底物誘導(dǎo)下或激活劑作用下，酶原C端水解，去6肽轉(zhuǎn)變成含有活性胰蛋白酶。-6肽胰蛋白酶原胰蛋白酶Ca+2激活劑親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第37頁3.1.2等電點(diǎn)與分子量：胰蛋白酶原pI=10.8，分子量：24000Da胰蛋白酶pI=8.9，分子量：23700Da

親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第38頁3.1.3穩(wěn)定性胰蛋白酶在酸性環(huán)境中很穩(wěn)定，在堿性環(huán)境中輕易自溶，在提取過程中要注意溶液pH值。

當(dāng)溶液pH2.0輕易變性pH=3.0生物活性穩(wěn)定pH7.0輕易自溶親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第39頁3.2胰蛋白酶原提取(1)勻槳:取約30克豬胰臟，剝?nèi)ソY(jié)締組織和脂肪，取凈重20-25克左右,剪成碎塊。轉(zhuǎn)移到組織搗碎器內(nèi),加入150ml預(yù)冷3.5%乙酸酸化水,勻槳.(2)提取:轉(zhuǎn)移到500ml燒杯中,用2mol/L硫酸調(diào)整pH值在3.5-4.0之間,10℃攪拌提取約4小時.(3)過濾:取一塊紗布,折疊成四層,用水潤濕,放在玻璃漏斗上,將胰蛋白酶原提取液過濾,搜集濾液.親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第40頁(4)酸化:用2mol/L硫酸調(diào)整濾液pH值至2.5-3.0之間,4℃冰箱靜止沉淀4小時以上。(5)過濾:折疊濾紙過濾,收濾液。

親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第41頁3.3胰蛋白酶原激活(1)調(diào)整pH值:用5mol/LNaOH將濾液準(zhǔn)確調(diào)整pH值至pH8.0,量取溶液體積.(2)加激活劑:加入固體CaCl2使溶液Ca+2終濃度到達(dá)0.1mol/L,然后加入約5mg結(jié)晶胰蛋白酶,混勻,激活.(3)激活時間:在4℃冰箱內(nèi)激活12-16小時,在25℃恒溫水浴中激活2-4小時.親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第42頁3.4停頓激活(1)活性測定:取1ml上清液分別測定蛋白濃度和活性.詳細(xì)操作見活性測定部分.(2)停頓激活:等酶溶液比活性到達(dá)1000u/mg左右,用2mol/L硫酸調(diào)整pH值到3.0.(3)過濾:濾紙過濾,濾去CaSO4沉淀,搜集濾液,4℃冰箱保留.

親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第43頁4親和層析分離胰蛋白酶(1)裝柱:取一支層析柱(10×1.0cm),將合成好親和層析介質(zhì)CHOM-Sepharose4B裝入柱內(nèi),自然沉降.(2)平衡:以0.1mol/L,pH8.0Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含0.5mol/LKCl,50mmol/LCaCl2)平衡.(3)上樣:將以經(jīng)激活胰蛋白酶提取液,用5mol/LNaOH準(zhǔn)確調(diào)整pH值至pH8.0,濾紙過濾,取濾液上樣.經(jīng)過親和介質(zhì)偶聯(lián)量和胰蛋白酶粗提液比活性,計(jì)算出上樣所需體積.計(jì)算方法以下:

親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第44頁

偶聯(lián)mg數(shù)×0.86×1.3×104(u/mg)上樣體積(ml)=粗酶濃度(mg/ml)×比活(u/mg)親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第45頁(4)平衡:

上完樣以后,以0.1mol/L,pH8.0Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含0.5mol/LKCl,50mmol/LCaCl2)平衡,洗去未被吸附雜蛋白。(5)洗脫:

等平衡到基線穩(wěn)定后,用0.1mol/L,pH2.5甲酸-0.5mol/LKCl溶液洗脫.搜集洗脫峰。親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第46頁(6)親和層析洗脫曲線:親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第47頁胰蛋白酶活性測定1胰蛋白酶活性測定1.1胰蛋白酶測定基本原理

胰蛋白酶是一個蛋白水解酶,它除了能水解堿性氨基酸與其它氨基酸形成肽鍵外,還能水解堿性氨基酸所形成酯鍵,催化活性含有高度專一性.所以,能夠用人工合成N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(N-benzoyl-L-argineethylester,簡稱BAEE)為底物測定胰蛋白酶活性.N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)在堿性條件下,經(jīng)胰蛋白酶作用水解去一個乙基生成N-苯甲酰-L-精氨酸(BA),催化反應(yīng)原理如圖所表示。

親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第48頁因?yàn)锽AEE在波長253nm處光吸收值遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于BA。所以，能夠在加入酶為零點(diǎn),測定在X分鐘內(nèi)遞增吸光值.經(jīng)過酶定義求出酶活性。

親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第49頁1.2測定胰蛋白酶活性定義底物濃度C=1mmol/L光程:L=1cm波長:λ=253nm1個BAEE單位溫度:T=25℃體積:V=3ml遞增值:ΔO.D=0.001A親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第50頁1.3計(jì)算公式(1)活性單位ΔO.DBAEE單位(u/ml)=×N(稀釋倍數(shù))0.001

(2)比活性測得BAEE活性單位(u/ml)BAEE單位(u/mg)=

胰蛋白酶濃度mg/ml)×加入體積(ml)

親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第51頁2雞卵粘蛋白活性測定

雞卵粘蛋白是胰蛋白酶天然抑制劑,通常1μg雞卵粘蛋白能抑制0.86μg胰蛋白酶活性(相當(dāng)于1:0.86).在胰蛋白酶液中加入適量雞卵粘蛋白,胰蛋白酶活性就會降低,胰蛋白酶遞減活性就是雞卵粘蛋白抑制活性.在一樣條件下分別測定出未加雞卵粘蛋白胰蛋白酶活性A1和加雞卵粘蛋白胰蛋白酶活性A2.將A1-A2就能夠得到雞卵粘蛋白抑制活性.計(jì)算公式以下:親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第52頁(1)抑制活性

A1–A2BAEE單位(Iu/ml)=×N(稀釋倍數(shù))0.001A1：胰蛋白酶活性A2：加雞卵粘蛋白胰蛋白酶活性(2)抑制比活測得BAEE活性單位(Iu/ml)BAEE單位(Iu/mg)=

雞卵粘蛋白濃度(mg/ml)×加入體積(ml)

親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第53頁3蛋白質(zhì)含量測定3.1消光系數(shù)定義：在蛋白質(zhì)分子中含有芳香族氨基酸，芳香族氨基酸在280nm處有最大吸收峰。蛋白質(zhì)分子中含有芳香族氨基酸數(shù)量以及分子緊密程度有差異，在280nm處光吸收強(qiáng)弱不一樣。在一定條件下，一個純蛋白質(zhì)在在280nm處光吸收值是一個常數(shù)。所以酶以純蛋白質(zhì)在280nm處都有一個消光系數(shù)A280。用符號表示為E1%1cm。這個符號定義是指在濃度為1%（W/V）蛋白質(zhì)溶液中，測定光程為1cm條件下，該蛋白吸光值。親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介專家講座第54頁如:胰蛋白酶E1%1cm是13.5，是指胰蛋白酶濃度為1%(g/100ml)，光程為1cm時光吸收值A(chǔ)280=13.5。當(dāng)胰蛋白酶濃度0.1g%(100mg/100ml)時，光程為1cm，光吸收值A(chǔ)280是1.35。當(dāng)雞卵粘蛋白濃度1%(g/100ml)時，A280是4.13，濃度1