蓬亂蛋白相關(guān)形態(tài)形成活化因子第1頁(yè)/共27頁(yè)早期研究表明在非洲爪蟾Daam蛋白主要對(duì)原腸有重要作用(Habasetal.,2001)而果蠅中DAAM突變表現(xiàn)出氣管缺陷(Matuseketal.,2006).這些早期的研究結(jié)果表明，Daam1影響的組織形態(tài)。

但在哺乳動(dòng)物中Daam1的生理功能迄今都了解不多第2頁(yè)/共27頁(yè)作者研究發(fā)現(xiàn)作者發(fā)現(xiàn)，Daam1在小鼠發(fā)育中的器官內(nèi)高效表達(dá)，包括心臟。研究使用Daam1-缺陷小鼠顯示，Daam1對(duì)于心臟形態(tài)發(fā)育是必不可少的在亞細(xì)胞水平，Daam1對(duì)于絲狀肌動(dòng)蛋（F-肌動(dòng)蛋白）組配和肌原組織以及細(xì)胞粘和定位是必須的。第3頁(yè)/共27頁(yè)材料與方法一、小鼠胚胎心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞培養(yǎng)二、RT-PCR和原位雜交三、免疫印跡—westernblot四、免疫熒光第4頁(yè)/共27頁(yè)五、細(xì)胞傷口愈合試驗(yàn)分析六、超聲心電圖分析第5頁(yè)/共27頁(yè)七、RhoA,Rac1andCdc42結(jié)構(gòu)域活性分析通過(guò)GSTpulldown技術(shù)八、用基因誘捕構(gòu)建的Daam1基因缺陷的小鼠模型1、胚胎干細(xì)胞系(cellNo.:RRT390)2、帶各種篩選、報(bào)告基因的誘捕載體第6頁(yè)/共27頁(yè)基因誘捕(genetrap)是基于小鼠胚胎干細(xì)胞、報(bào)道載體(誘捕載體)建立的一種基因突變方法。誘捕載體在整合位點(diǎn)利用內(nèi)源基因調(diào)控元件模仿內(nèi)源基因表達(dá),使其表達(dá)終止。LTR報(bào)告基因，由上游啟動(dòng)子起始表達(dá)；SA,剪接受體;GFNR,綠熒光硝基還原酶基因;pPKG,PKG啟動(dòng)子;neo,新霉素抗性基因?；蛘T捕載體系統(tǒng)(ROSA-GFNR)結(jié)構(gòu)示意圖第7頁(yè)/共27頁(yè)本文作者首先得到一個(gè)在Daam1處插入了突變型小鼠胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞株(cellNo.:RRT390)，可以接受報(bào)告載體的整合。構(gòu)建了一個(gè)lacZ及新霉素篩選位點(diǎn)，融合進(jìn)入ES，導(dǎo)入C57BL/6J品系小鼠內(nèi)繁殖的第一代即為基因缺陷型小鼠。第8頁(yè)/共27頁(yè)結(jié)果圖A-a：基因誘捕載體示意圖圖A-b：蛋白印跡和DNA電泳圖16.5d胚胎，Het為Daam1等位基因，Mut為純合突變第9頁(yè)/共27頁(yè)圖B:DNA電泳和蛋白印跡圖。16.5d胚胎各器官，Het為Daam1等位基因，Mut為純合突變第10頁(yè)/共27頁(yè)1、表明Daam1基因缺陷的小鼠模型構(gòu)建成功2、Daam1在小鼠各處器官均有表達(dá)第11頁(yè)/共27頁(yè)Daam1在正常小鼠中的表達(dá)譜A--a-c：8.5-10.5d小鼠胚胎原位雜交檢測(cè)Daam1的表達(dá)d-e：10.5d切片分析AVC，房室墊;EC，心內(nèi)膜;EPC，心外膜;圖B：8.5-10.5dDaam1在心臟和腦中PCR檢測(cè)第12頁(yè)/共27頁(yè)Daam1突變小鼠中用半乳糖苷酶染色切片分析發(fā)現(xiàn)Daam1在小鼠全身表達(dá)，在心臟處高表達(dá)10.5d表達(dá)強(qiáng)烈第13頁(yè)/共27頁(yè)發(fā)育的心臟和

神經(jīng)管用免疫熒光染色E12.5胚胎冰凍切片。WGA：麥胚凝集素特異性染心肌細(xì)胞膜DAPI：特異性然細(xì)胞質(zhì)第14頁(yè)/共27頁(yè)Daam1gt/gt小鼠的心臟表型和功能特性。切片分析E14.5d、f：DORV畸形h、IVSD畸形第15頁(yè)/共27頁(yè)切片分析P0d、f、h：DORV畸形j：VSD畸形第16頁(yè)/共27頁(yè)2月齡Daam1小鼠的病理分析圖C：Daam1突變小鼠左心室壁出現(xiàn)腦回溝疏松結(jié)構(gòu)（箭頭所示）圖D-a：心臟與身體的比重。圖D-b：超聲波心電圖分析。表明Daam1突變型小鼠LV心肌變厚。第17頁(yè)/共27頁(yè)Daam1gt/gt拯救小鼠通過(guò)NKx2.5Cre小鼠與Daam1gt/gt小鼠雜交獲得Daam1拯救型小鼠。圖A：基因示意圖圖B:E10.5半乳糖苷酶染色表明拯救成功第18頁(yè)/共27頁(yè)E14.5胚胎組織切片

Daam1gt/gt/Nkx2-5Cre/+胚胎（B，D，F(xiàn)）表現(xiàn)出正常的心臟結(jié)構(gòu)第19頁(yè)/共27頁(yè)1周齡小鼠組織切片。

daam1gt/+（A，D）和Daam1gt/gt/Nkx2-5Cre/+（C，F(xiàn)）小鼠表現(xiàn)出正常的室壁和小梁。Daam1gt/gt突變小鼠（B，E）顯示

心室致密。第20頁(yè)/共27頁(yè)作者發(fā)現(xiàn)Daam1缺陷病不影響心肌細(xì)胞分化，增殖或凋亡通過(guò)Nkx2-5,Tbx20andGata4心臟早期發(fā)育基因,形態(tài)發(fā)生蛋白BMP10心室標(biāo)志性基因MLC2A、MLC2V都無(wú)顯著差異表達(dá)第21頁(yè)/共27頁(yè)圖A：只有Daam1gt/gt小鼠饑餓后F-肌動(dòng)蛋白明顯降低表達(dá)圖B：E12.5心臟中肌動(dòng)蛋白熒光分析表明，只有Daam1gt/gt小鼠肌動(dòng)蛋白表達(dá)量很低第22頁(yè)/共27頁(yè)以上結(jié)果表明：在心肌細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的形成和橫紋肌組織的形成是需要Daam1的Daam1gt/gt小鼠在心肌細(xì)胞中橫紋肌的形成受到干擾第23頁(yè)/共27頁(yè)圖A:E12.5Daam1gt/gt小鼠心肌細(xì)胞的粘附蛋白α-catenin和N-cadherin表達(dá)明顯混亂圖B：Daam1gt/gt小鼠橋粒連接異常第24頁(yè)/共27頁(yè)圖C:E12.5Daam1gt/gt小鼠心肌黏接細(xì)胞排列無(wú)規(guī)則圖D：Daam1gt/gt小鼠連接細(xì)胞變少圖d：為差異分析Daam1在心肌細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞粘附是非常重要的第25頁(yè)/共27頁(yè)Daa