實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離基本要求1.進行大腸桿菌的擴增，利用液體培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng)的操作。2.進行大腸桿菌的分離，用固體平面培養(yǎng)基進行細菌的培養(yǎng)。目前一頁\總數三十三頁\編于十八點一、大腸桿菌

革蘭氏陰性、兼性厭氧的腸道桿菌在腸道中一般對人無害但也有一些菌株對人體是有害的，可侵襲腸粘膜并產生毒素任何大腸桿菌如果進入人的泌尿系統，都會對人體產生危害。目前二頁\總數三十三頁\編于十八點結晶紫碘液95%乙醇革蘭氏染色法1min革蘭陽性革蘭陰性1min脫色復染目前三頁\總數三十三頁\編于十八點菌落（colony）：一個細菌細胞在固體培養(yǎng)基上發(fā)展成一個肉眼可見，具一定形態(tài)結構的子細胞群。光滑型菌落粗糙型菌落目前四頁\總數三十三頁\編于十八點目前五頁\總數三十三頁\編于十八點二、細菌的培養(yǎng)和分離1、實驗儀器設備：移液槍目前六頁\總數三十三頁\編于十八點接種環(huán)玻璃刮刀目前七頁\總數三十三頁\編于十八點超凈工作臺（保證無菌環(huán)境）目前八頁\總數三十三頁\編于十八點高壓蒸汽滅菌鍋目前九頁\總數三十三頁\編于十八點恒溫培養(yǎng)箱目前十頁\總數三十三頁\編于十八點搖床目前十一頁\總數三十三頁\編于十八點2、培養(yǎng)基：平板斜面固體培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：蛋白胨：0.5g酵母提取物：0.25gNaCl:0.5gH2O:50mL瓊脂：1g液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基調pH值目前十二頁\總數三十三頁\編于十八點菌膜菌沉淀均勻渾濁對照液體培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）目前十三頁\總數三十三頁\編于十八點3、實驗步驟：（1）培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿滅菌

——高壓蒸汽滅菌法

將配制好的50mlLB液體和固體培養(yǎng)基分別裝入250ml三角瓶中，加上封口膜；

將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好；置于滅菌鍋內1kg壓力滅菌15min

（121℃）目前十四頁\總數三十三頁\編于十八點無菌技術

最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞（不能用脫脂棉：易吸水引起后引起污染），也可采用各種金屬、塑料、封口膜及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。（160℃2h或170℃1h）目前十五頁\總數三十三頁\編于十八點高壓蒸汽滅菌法：玻璃器皿、金屬、移液槍頭等（火焰）灼燒：接種環(huán)、試管口、三角燒瓶口紫外燈+過濾風：超凈臺滅菌消毒：70%酒精棉球（消毒：利用化學或物理方法，殺死大部份致病微生物的過程。）目前十六頁\總數三十三頁\編于十八點（2）倒平板

滅菌后，待滅菌鍋壓力與大氣壓力相同時打開鍋蓋將有培養(yǎng)基的三角瓶和培養(yǎng)皿放到超凈臺上打開超凈臺的紫外燈和過濾風，待固體培養(yǎng)基冷卻到60℃時，關閉紫外燈用酒精棉球消毒桌面和手。目前十七頁\總數三十三頁\編于十八點倒平板：10-12ml培養(yǎng)基/培養(yǎng)皿

每倒入一個后立即置于水平位置上，輕輕晃動，使培養(yǎng)基鋪滿平皿底部，待凝，并形成平面。酒精燈旁：左手？右手？目前十八頁\總數三十三頁\編于十八點制作試管斜面：

將配制好的呈熔化狀態(tài)的培養(yǎng)基轉移到試管中時必須用三角漏斗

滅菌試管冷卻到50℃左右，把試管棉塞一端擱在玻棒上，待冷凝后即成試管斜面

將分裝好的含培養(yǎng)基的試管滅菌P21小字部分目前十九頁\總數三十三頁\編于十八點1/3在試管外，2/3在試管內正確不正確棉塞制作目前二十頁\總數三十三頁\編于十八點（3）接種培養(yǎng)

左手：將大腸桿菌斜面和有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶，靠近酒精燈火焰；

右手：拿接種環(huán)，并用無名指和小指夾住斜面的棉塞和三角瓶的封口膜；

接種環(huán)在火焰上燒紅，再深入到斜面，使環(huán)接觸培養(yǎng)基，再取菌體；

將菌體放入三角瓶的液體培養(yǎng)基中，瓶口封口膜和管口棉塞復原；

將三角瓶置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)12h。目前二十一頁\總數三十三頁\編于十八點目前二十二頁\總數三十三頁\編于十八點（4）劃線分離

在酒精燈火焰上灼燒接種環(huán)；

將搖床上培養(yǎng)了12h的菌液打開，接種環(huán)部分深入到菌液中；

在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線，接種環(huán)只在菌液中蘸菌液一次，劃線后蓋好培養(yǎng)皿；

將培養(yǎng)皿倒置（蓋在下面），放到恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24h后，可看到在劃線的末端出現不連續(xù)的單個菌落，表明菌已被分離。目前二十三頁\總數三十三頁\編于十八點劃線分離法劃線的起點要有菌，且每一次新的起點應比前一次的起點菌含量（濃度）低劃線的最終點不能與前面的劃線點重疊除第1次外，其余幾次劃線前，都要將接種環(huán)火焰灼燒目前二十四頁\總數三十三頁\編于十八點恒溫培養(yǎng)箱平板倒置防止培養(yǎng)皿蓋上的冷凝水滴落入培養(yǎng)基表面，使菌落中的菌隨水擴散，造成污染。目前二十五頁\總數三十三頁\編于十八點劃線分離法目前二十六頁\總數三十三頁\編于十八點（5）斜面接種保存

在無菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在斜面上。37℃培養(yǎng)24h后，4℃冰箱保存。目前二十七頁\總數三十三頁\編于十八點涂布分離法目前二十八頁\總數三十三頁\編于十八點首先，涂布分離法的操作比劃線分離法更復雜。因為涂布分離法包括先將菌液稀釋的步驟，而且通常要稀釋多個濃度，常稀釋到10-5-10-7倍。（稀釋實驗過程見P26圖）在涂布時，從不同稀釋度的稀釋菌液中各取0.1ml放在平板固體培養(yǎng)基上，再用玻璃刮刀涂布后培養(yǎng)。其次，涂布分離法更易分開單菌落。通常培養(yǎng)皿中有20個以內的單菌落為最合適。目前二十九頁\總數三十三頁\編于十八點土樣稀釋目前三十頁\總數三十三頁\編于十八點液樣稀釋目前三十一頁\總數三十三頁\編于