3-1概述

HPLC是60年代在GC和經(jīng)典液相色譜根底上開展起來的。

GC柱效高，且能別離、定量，但有些熱穩(wěn)定性差，不易揮發(fā)的組分不能用GC直接分析，人們想到模仿GC，用細顆粒固定相，薄殼固定液，以增加柱效。模仿LC用液體作流動相，在室溫下進行，但阻力太大，液體流動相難以通過，所以又想到加高壓泵，加快流動相流速，這樣即增加了柱效，又加快了分析速度，也拓寬了應(yīng)用范圍，把柱子、高壓泵、檢測器配成儀器，就形成高效液相色譜儀。1第一頁，共48頁。HPLC與LC的比較

LCHPLC柱徑1～2cm2～5mm顆粒150～200μm5～10μm壓力常壓高壓

tR1～20h1h內(nèi)

n2～50105/米用途初步別離高效別離、高靈敏度定量

HPLC優(yōu)點：柱效高分析時間短可定量儀器分析2第二頁，共48頁。HPLC與GC的比較

GCHPLC流動相gl溫度高溫室溫組分易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性好不受限制可測有機物20%75%～80%tR1～30min1～60min靈敏度10-12～10-14g/ml10-9～10-11g流出物不易收集易收集

HPLC優(yōu)點：應(yīng)用范圍廣，組分易回收3第三頁，共48頁。GC與HPLC選擇：小分子——熱穩(wěn)定性好——GC大分子——熱穩(wěn)定性差——HPLCtR短GC優(yōu)點：

g廉價靈敏度高4第四頁，共48頁。

二.

HPLC法的特點：

1.高效別離n=105/米

2.高速使用高壓泵，出峰時間幾分鐘到幾十分鐘

3.高靈敏度檢測下限：10-9～10-13g〔最小檢測量〕4.自動化程度高〔儀器分析、電腦控制、色譜工作站〕5.應(yīng)用范圍廣可測有機物75%～80%一.HPLC法的分類

吸附色譜

l—s離子交換色譜法尺寸排阻色譜法l—l正向色譜反向色譜5第五頁，共48頁。二、高效液相色譜法的特點

featureofHPLC

特點：高壓、高效、高速、高靈敏度高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效別離分析方法。6第六頁，共48頁。分配系數(shù)K=組分在固定相中的濃度/組分在流動相中的濃度

=CS/CM

分配系數(shù)的差異是所有色譜別離的實質(zhì)性原因3-2影響別離的因素

factorsinfluencedseparation7第七頁，共48頁。1.影響別離的因素與提高柱效的途徑在高效液相色譜中,液體的擴散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，那么速率方程中的分子擴散項B/U較小，可以忽略不計，即：

H=A+Cu

故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如下圖。8第八頁，共48頁。

液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。

液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)。恒溫改變淋洗液組成、極性是改善別離的最直接的因素。9第九頁，共48頁。

2.流速

流速大于0.5cm/s時,H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實際操作中，流量仍是一個調(diào)整別離度和出峰時間的重要可選擇參數(shù)。

氣相色譜中的固定液原那么上都可以用于液相色譜，其選用原那么與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，別離柱的制備是一項技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。10第十頁，共48頁。

高效液相色譜儀由五大局部組成：高壓輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)別離系統(tǒng)檢側(cè)系統(tǒng)記錄及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析流程：流動相1高壓泵進樣器流動相貯液槽壓力表流動相2微機梯度洗脫裝置色譜柱餾分收集器檢測器11第十一頁，共48頁。儲液瓶分布器過濾2m高壓泵入口檢查出口檢查脈流消除抽氣過濾器反壓調(diào)節(jié)壓力計注樣閥分離柱到檢測器HPLC儀器詳解12第十二頁，共48頁。13第十三頁，共48頁。14第十四頁，共48頁。一.高壓輸液系統(tǒng)1.高壓輸液泵：恒壓泵〔流量隨阻力變化重現(xiàn)性差〕恒流泵〔多用〕：往復(fù)式注射式

作用：將流動相在高壓下連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)。性能：①有足夠的壓力②輸出流量恒定，可調(diào)③輸出壓力平穩(wěn)④泵室體積?、荼皿w抗腐蝕、耐酸馬達往復(fù)式拉動密封溶劑球閥脈動阻尼器到色譜柱機械往復(fù)柱塞泵示意圖15第十五頁，共48頁。2.

梯度洗脫裝置作用：將兩種或兩種以上溶劑按一定程序連續(xù)改變配比，以改變流動相極性、離子強度、PH值、提高別離效率。低壓梯度洗脫〔常壓混合，高壓進柱，1個泵?！?/p>

高壓梯度洗脫〔高壓混合，高壓進柱，2個泵。〕貯液槽1貯液槽2貯液槽1貯液槽2

梯度洗脫裝置程序控制高壓泵1高壓泵2

混合室高壓泵梯度洗脫裝置進柱進柱低壓梯度洗脫高壓梯度洗脫不易改變流動向配比,自動化程度低隨時改變流動向配比,自動化程度高16第十六頁，共48頁。

二.進樣系統(tǒng)

注射進樣：裝置簡單、死體積小。但進樣量小且重現(xiàn)性差。六通閥進樣：目前最常用，由于進樣量可由樣品管控制，因此進樣準確，重復(fù)性好，如圖。

圖12-5六通閥進樣示意圖a．載樣(樣品進入定量管)b．倒閥(樣品導(dǎo)入色譜柱)1．定量管2．樣品進入口3．流動相進口4．色譜柱1.載樣管17第十七頁，共48頁。裝入樣品出口進樣采樣環(huán)泵入溶劑進色譜柱18第十八頁，共48頁。

三.別離系統(tǒng)：色譜柱不銹鋼直型分析：內(nèi)徑2～6mm長10～30cm

制備：內(nèi)徑10～25mm長15～50cm

恒溫器：電熱恒溫裝置〔室溫～150℃〕

恒溫水浴類套〔70℃以下〕

作用：保證分析時溫度恒定，否那么對tR影響較大19第十九頁，共48頁。

四.檢測系統(tǒng)

1.

紫外—可見光度檢測器：

①固定波長：254nm，低壓汞燈。

②可調(diào)波長：190～800mm，鎢燈，氘燈。

③光電二極管矩陣檢測器：190～700nm。石英窗接色譜柱UV光電倍增管廢液20第二十頁，共48頁。

光電二極管矩陣檢測器特點：靈敏度高、分辨率好、方便、快速、準確，可掃描得三維流出曲線紫外檢測器的應(yīng)用：

對紫外有吸收的組分，且吸光度與濃度成正比。

紫外檢測器的特點：靈敏度高最小檢測濃度10-9g/ml

線性范圍寬對溫度和流速不敏感，可進行梯度洗脫應(yīng)用范圍廣21第二十一頁，共48頁。波長可的松氟美松皮質(zhì)酮快速掃描—光電二極管陣列〔PDA〕檢測所獲得的三維色譜-光譜圖22第二十二頁，共48頁。2.熒光檢測器：多波長熒光檢測器〔濾光片〕熒光分光檢測器〔光柵分光〕氘燈作激發(fā)光源，波長范圍250～600nm應(yīng)用：組分吸收一定波長紫外光后發(fā)射熒光的物質(zhì)，且熒光強度與濃度成正比。特點：靈敏度更高檢測限10-12～10-13g/ml〔靈敏度比UV檢測器高2~3個數(shù)量級〕選擇性好對溫度和流速不敏感，可進行梯度洗脫所需試樣量少，適于痕量分析應(yīng)用范圍廣3、電化學(xué)檢測器電導(dǎo)、庫侖、極譜、安培、電位等檢測器。23第二十三頁，共48頁。一、液-固吸附色譜liquid-solidadsorptionchromatograph二、液-液分配色譜liquid-liquidpartitionchromatograph三、離子交換色譜ion-exchange

chromatograph四、離子色譜ionchromatograph五、離子對色譜ion-pairchromatograph六、排阻色譜size-exclusionchromatograph七、親和色譜(AC)Affinity

chromatograph3-3主要別離類型與原理basicprincipleandmainseparatingtypes24第二十四頁，共48頁。一、液-固吸附色譜

liquid-solidadsorptionchromatography

固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。根本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；適用于別離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；25第二十五頁，共48頁。二、液-液分配色譜

liquid-liquidpartitionchromatography

固定相與流動相均為液體〔互不相溶〕；根本原理：組分在固定相和流動相上的分配；流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性〔正相normalphase〕，反之，流動相的極性大于固定液的極性〔反相reversephase〕。正相與反相的出峰順序相反；固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；化學(xué)鍵合固定相：將各種不同基團通過化學(xué)反響鍵合到硅膠〔擔體〕外表的游離羥基上。C-18柱〔反相柱〕。26第二十六頁，共48頁。三、離子交換色譜

ion-exchangechromatography

固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；流動相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；根本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反響；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保存時間長；陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。27第二十七頁，共48頁。四、離子色譜

ionchromatography

離子色譜是在20世紀70年代中期開展起來的一中技術(shù)，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測器，是測定混合陰離子的有效方法。

28第二十八頁，共48頁。五、離子對色譜

ionpairchromatography

原理：將一種〔或多種〕與溶質(zhì)離子電荷相反的離子〔對離子或反離子〕加到流動相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進行分配；陰離子別離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子；陽離子別離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；反相離子對色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動相，試樣離子X-進入流動相后，生成疏水性離子對Y+X-后；在兩相間分配。29第二十九頁，共48頁。六、排阻色譜

size-exclusionchromatography

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小別離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過局部凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對相對分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量別離30第三十頁，共48頁。七、親和色譜(AC)

Affinitychromatograph

原理：利用生物大分子和固定相外表存在的某種特異性親和力，進行選擇性別離。

先在載體外表鍵合上一種具有一般反響性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保存。改變淋洗液后洗脫。31第三十一頁，共48頁。一、液相色譜固定相stationaryphaseofHPLC二、液相色譜流動相

mobilephaseofHPLC3-4液相色譜的固定相與流動相stationaryphaseandmobilephaseofHPLC32第三十二頁，共48頁。一、液相色譜固定相

stationaryphasesofLC1.液-液分配及離子對別離固定相〔1〕全多孔型擔體由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，外表涂漬固定液，性能不佳已不多見；現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；〔2〕外表多孔型擔體〔薄殼型微珠擔體〕30～40μm的玻璃微球，外表附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。外表積小，柱容量底；33第三十三頁，共48頁?！?〕化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最正確的固定相；a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—Cb.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—C穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應(yīng)用最廣；c.硅碳鍵型：≡Si—Cd.硅氮鍵型：≡Si—N34第三十四頁，共48頁?；瘜W(xué)鍵合固定相的特點〔1〕傳質(zhì)快，外表無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；〔2〕壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；耐水、耐光、耐有機溶劑，穩(wěn)定；〔4〕選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性；〔5〕有利于梯度洗脫；

存在著雙重別離機制：(鍵合基團的覆蓋率決定別離機理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；

35第三十五頁，共48頁。2.液-固吸附別離固定相

種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm；

36第三十六頁，共48頁。3.離子交換色譜別離固定相結(jié)構(gòu)類別：〔1〕薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔體，外表涂約1%的離子交換樹脂；〔2〕離子交換鍵合固定相薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型〔鍵合離子交換基團〕樹脂類別：〔1〕陽離子交換樹脂〔強酸性、弱酸性〕〔2〕陰離子交換樹脂〔強堿性、弱堿性〕37第三十七頁，共48頁。4.空間排阻別離固定相〔1〕軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動相。適用于常壓排阻別離?！?〕半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機凝膠；非極性有機溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑〔3〕硬質(zhì)凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機械強度大，流動相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用。可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布。38第三十八頁，共48頁。二、液相色譜的流動相

mobilephasesofLC1.流動相特性

〔1〕液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分別離狀況；

〔2〕親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。

〔3〕假設(shè)流動相的極性大于固定液的極性，那么稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型別離柱上的出峰順序相反。39第三十九頁，共48頁。2.流動相類別

按流動相組成分：單組分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進別離或調(diào)整出峰時間。40第四十頁，共48頁。3.流動相選擇

在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配別離時：首先選擇中等極性溶劑，假設(shè)組分的保存時間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保存時間縮短。常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴