15新型PCR檢測(cè)技術(shù)解析第一頁(yè)，共42頁(yè)。回顧上節(jié)課所學(xué)PCR五個(gè)要素①模板：?jiǎn)捂溁螂p鏈DNA②引物：16-30bp合成的寡核苷酸③DNA聚合酶：耐熱的Taq④底物：四種脫氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)⑤液態(tài)反應(yīng)體系：其中Mg2+是DNA聚合酶的激活劑基本程序⑴94℃30s變性⑵50-60℃30’’-1’復(fù)性（使引物與模板充分退火）⑶72℃n’(按1’擴(kuò)增1kb計(jì)算）延伸⑷

25-35個(gè)循環(huán)第二頁(yè)，共42頁(yè)?；緝?nèi)容一、多重PCR二、熒光定量PCR的原理三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR與常規(guī)的PCR的差別五、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用六、課堂小結(jié)七、作業(yè)第三頁(yè)，共42頁(yè)。一、多重PCR1、定義：

它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過(guò)程與一般PCR相同。

區(qū)別在多對(duì)引物需要設(shè)計(jì)。

第四頁(yè)，共42頁(yè)。2、多重PCR的步驟：⑴多重PCR擴(kuò)增區(qū)域的選擇。⑵多對(duì)引物的設(shè)計(jì)。⑶反應(yīng)條件的選擇及反應(yīng)體系的優(yōu)化（引物濃度、模板濃度、dNTP及酶的濃度、Mg2+濃度、加入DMSO、甘油或者BSA、PCR循環(huán)參數(shù)的設(shè)定）。⑷結(jié)果分析一、多重PCR第五頁(yè)，共42頁(yè)。一、多重PCR第六頁(yè)，共42頁(yè)。3、多重PCR的特點(diǎn)①高效性

在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出多種病原微生物，或?qū)τ卸鄠€(gè)型別的目的基因進(jìn)行分型，特別是用一滴血就可檢測(cè)多種病原體。②系統(tǒng)性

多重PCR很適宜于成組病原體的檢測(cè)，如肝炎病毒，腸道致病性細(xì)菌，性病，無(wú)芽胞厭氧菌，戰(zhàn)傷感染細(xì)菌及細(xì)菌戰(zhàn)劑的同時(shí)偵檢。③經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性

多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出，將大大的節(jié)省時(shí)間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費(fèi)開(kāi)支，為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。一、多重PCR第七頁(yè)，共42頁(yè)。4、多重PCR的應(yīng)用（5個(gè)實(shí)例）例一

肝炎病毒的感染，在同一病人體內(nèi)，有時(shí)存在多種肝炎病毒重疊感染。有時(shí)是甲乙丙型肝炎病毒重疊;有時(shí)可能是甲乙型肝炎病毒重疊;有時(shí)是乙丙型肝炎病毒重疊.一、多重PCR第八頁(yè)，共42頁(yè)。4、多重PCR的應(yīng)用（5個(gè)實(shí)例）例二

腸道致病性細(xì)菌的檢測(cè)，如傷寒，痢疾和霍亂，有時(shí)具有較相同的腸道癥狀，有時(shí)痢疾霍亂同存一病人并同時(shí)發(fā)病.一、多重PCR第九頁(yè)，共42頁(yè)。4、多重PCR的應(yīng)用（5個(gè)實(shí)例）例三

性病的檢測(cè)，如梅毒，淋病及艾滋病的診斷.

戰(zhàn)傷細(xì)菌及生物戰(zhàn)劑細(xì)菌的檢測(cè)，如破傷風(fēng)桿菌，產(chǎn)氣莢膜桿菌，炭疽桿菌，鼠疫桿菌等偵檢.

需特殊培養(yǎng)的無(wú)芽胞厭氧菌，如脆弱類桿菌、艱難桿菌的鑒定等.一、多重PCR第十頁(yè)，共42頁(yè)。4、多重PCR的應(yīng)用（5個(gè)實(shí)例）例四

某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。遺傳病或癌基因，型別較多，或突變或缺失存在多個(gè)好發(fā)部位，通過(guò)常規(guī)PCR很難檢測(cè)出來(lái)。例五

植物種質(zhì)鑒定、植物病毒的檢測(cè)、分子育種、快速檢測(cè)外源基因的整合狀態(tài)。一、多重PCR第十一頁(yè)，共42頁(yè)。二、熒光定量PCR的原理

熒光定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。第十二頁(yè)，共42頁(yè)。二、熒光定量PCR的原理熒光定量PCR最常用于基因表達(dá)產(chǎn)物的分析，即將轉(zhuǎn)錄生成的單鏈mRNA逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈的cDNA,以此cDNA為模板進(jìn)行反應(yīng)。（動(dòng)畫(huà)）第十三頁(yè)，共42頁(yè)。

熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。1、

熒光探針

PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'→3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與PCR的產(chǎn)物數(shù)量成正比，根據(jù)測(cè)量到的熒光信號(hào)強(qiáng)弱，通過(guò)分析軟件得到樣本的原始拷貝數(shù)。二、熒光定量PCR的原理第十四頁(yè)，共42頁(yè)。1、熒光探針二、熒光定量PCR的原理第十五頁(yè)，共42頁(yè)。1、熒光探針二、熒光定量PCR的原理第十六頁(yè)，共42頁(yè)。1、熒光探針二、熒光定量PCR的原理第十七頁(yè)，共42頁(yè)。1、熒光探針二、熒光定量PCR的原理第十八頁(yè)，共42頁(yè)。1、熒光探針二、熒光定量PCR的原理第十九頁(yè)，共42頁(yè)。

2、熒光染料

在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量熒光染料，熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。二、熒光定量PCR的原理第二十頁(yè)，共42頁(yè)。2、熒光染料二、熒光定量PCR的原理第二十一頁(yè)，共42頁(yè)。2、熒光染料二、熒光定量PCR的原理觀看視頻動(dòng)畫(huà)第二十二頁(yè)，共42頁(yè)。熒光探針特異性高探針設(shè)計(jì)要求高合成費(fèi)用高多重PCR檢出熒光染料簡(jiǎn)便易行價(jià)格便宜要求反應(yīng)的特異性不能進(jìn)行多重PCR二、熒光定量PCR的原理3、熒光探針和熒光染料的區(qū)別第二十三頁(yè)，共42頁(yè)。熒光探針SNP解析病毒、病原菌的檢測(cè)熒光染料mRNA表達(dá)量分析二、熒光定量PCR的原理4、熒光探針和熒光染料的用途第二十四頁(yè)，共42頁(yè)。三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理

1、Ct值

在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個(gè)很重要的概念--Ct值。

C代表Cycle，t代表threshold（臨界值）。

Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

。第二十五頁(yè)，共42頁(yè)。

2、Ct值與起始模板的關(guān)系

每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理

第二十六頁(yè)，共42頁(yè)。三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理

Ct起始拷貝數(shù)或起始濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線第二十七頁(yè)，共42頁(yè)。三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理3、數(shù)據(jù)測(cè)定在實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系中，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長(zhǎng)，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)與之對(duì)應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號(hào)強(qiáng)度，求得Ct值。再利用數(shù)個(gè)已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，即可得出待測(cè)標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)。第二十八頁(yè)，共42頁(yè)。三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理3、數(shù)據(jù)測(cè)定第二十九頁(yè)，共42頁(yè)。三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理3、數(shù)據(jù)測(cè)定Rn(熒光信號(hào))循環(huán)數(shù)CycleNumber第三十頁(yè)，共42頁(yè)。三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理3、數(shù)據(jù)測(cè)定操作過(guò)程第三十一頁(yè)，共42頁(yè)。四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR與常規(guī)PCR的差別2、分析對(duì)象的差別：1、原理的差別：動(dòng)畫(huà)視頻第三十二頁(yè)，共42頁(yè)。四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR與常規(guī)PCR的差別3、使用儀器及結(jié)果輸出形式的差別：第三十三頁(yè)，共42頁(yè)。五、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用1.病原體檢測(cè)2.產(chǎn)前診斷3.藥物療效考核4.腫瘤基因檢測(cè)5.新藥開(kāi)發(fā)研究6.超早期感染用藥物及療法的研究與開(kāi)發(fā)第三十四頁(yè)，共42頁(yè)。1、病原體檢測(cè)

目前，采用熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)可以對(duì)淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結(jié)核分枝桿菌、EB病毒和巨細(xì)胞病毒等病原體進(jìn)行定量測(cè)定。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。五、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用第三十五頁(yè)，共42頁(yè)。2、產(chǎn)前診斷

到目前為止，人們對(duì)遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無(wú)法治療，只能通過(guò)產(chǎn)前監(jiān)測(cè)，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生。

如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其Y性別決定區(qū)基因是一種無(wú)創(chuàng)傷性的方法，易為孕婦所接受。五、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用第三十六頁(yè)，共42頁(yè)。3、藥物療效考核

比如，對(duì)乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關(guān)系。HCV高水平表達(dá)，干擾素治療作用不敏感。五、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用第三十七頁(yè)，共42頁(yè)。

癌基因的表達(dá)增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現(xiàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR不但能有效地檢測(cè)到基因的突變，而且可以準(zhǔn)確檢測(cè)癌基因的表達(dá)量。

目前用此方法進(jìn)行過(guò)端粒酶hTERT基因、慢性粒細(xì)胞性白血病WT1基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達(dá)檢測(cè)。五、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用4、腫瘤基因檢測(cè)第三十八頁(yè)，共42頁(yè)。5、新藥開(kāi)發(fā)研究

針對(duì)一些感染性疾病的藥物，如各種病毒病、細(xì)菌病等，在新藥的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，快速了解藥物對(duì)疾病進(jìn)程的影響可以為新藥開(kāi)發(fā)節(jié)約大量的人力、時(shí)間和資金，與以前所用的常規(guī)方法相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確、定量、靈敏地測(cè)定血液或組織中病原體的含量，因此有利用分析藥物的作用效果，為比較不同的配方的療效、用藥量、用藥時(shí)間等等提供快速、定量的評(píng)價(jià)。五、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用第三十九頁(yè)，共42頁(yè)。6、超早期感染用藥物及療法的研究與開(kāi)發(fā)