第三節(jié)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)

/.../Archive/Mar-05-2004.html1GB/T4789.6-2003

致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)21.概述2.生物學(xué)特性3.致病性4.培養(yǎng)基和試劑5.檢驗(yàn)程序6.毒素檢測(cè)7.快速檢測(cè)6

1.概述

大腸埃希氏菌(Escherichia.coli;E.coli)，俗稱大腸桿菌，是人類和動(dòng)物腸道中正常菌群的主要成員，糞便約含109個(gè)/g。E.coli隨糞便排出后，廣泛分布于自然界。水、牛乳及其他食品或物品一旦檢出大腸埃希氏菌，即意味著這些物品直接或間接被糞便污染。

http://pic./showimg.php?q=E.coli&pg=1&tp=0&pid=57按對(duì)宿主的作用將大腸埃希氏菌分為三類：

益生菌：不致病，能合成維生素B和維生素K，生產(chǎn)大腸菌素，對(duì)機(jī)體有利；

條件致病菌：在機(jī)體內(nèi)外因素所致抵抗力下降或菌體侵入腸外組織或器官條件下致病；

致病菌：引起腸道感染,有四類.

8致瀉大腸埃希氏菌有四類：

產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(enterotoxigenic

E.coli，ETEC）腸出血性大腸埃希氏菌(enterohemorrhagic

E.coli，EHEC)

腸道侵襲性大腸埃希氏菌(enteroinvasive

E.coli，EIEC)

腸道致病性大腸埃希氏菌(enteropathogenic

E.coli，EPEC）

帶菌的人、牛和豬是傳播本菌引起食物中毒最重要原因。2.生物學(xué)特性

1)形態(tài)與染色

2)培養(yǎng)特性3)生化特性

4）抵抗力

5）抗原性與分類

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91)形態(tài)與染色

G－、有鞭毛和菌毛、無芽孢或有莢膜，兩端鈍圓短桿菌。大小為(1.1－1.5)μmX(2.0－6.0)μm(活菌)或(0.4－0.7)μmX(1.0－3.0)μm

(染色菌)，絕大多數(shù)菌株有周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，周身還有菌毛，無芽孢，某些菌株具有莢膜。

/genomics/images/e_coli_200.jpg2)培養(yǎng)特性

在普通培養(yǎng)基上：長(zhǎng)成2－3mm的S型小菌落；

在鮮血瓊脂平板上:生長(zhǎng)，有些菌株可見β型溶血環(huán)**；

在麥康凱培養(yǎng)基上:因發(fā)酵乳糖而產(chǎn)生有色菌落；

在SS培養(yǎng)基上:大腸桿菌一般不能生長(zhǎng)，少數(shù)生長(zhǎng)的菌落也因發(fā)酵乳糖而呈紅色；

在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上:生長(zhǎng)成紫黑色帶有金屬光澤的菌落；

在液體培養(yǎng)基中:呈均勻混濁生長(zhǎng)，形成莢膜，管底有粘性沉淀培養(yǎng)物呈特殊的臭味。10**血液瓊脂平板上的菌落周圍溶血情況：

甲(α)型溶血：有草綠色溶血環(huán)乙(β)型溶血：呈透明溶血環(huán)/200309/a0309180101.jpghttp://www.sat.affrc.go.jp/joseki/Tonseki/Tonseki_Bhcolony.jpg113)生化特性

大腸埃希氏菌發(fā)酵多種糖，，如葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、山梨醇和丙三醇等；大部分菌株可迅速發(fā)酵乳糖，各菌株對(duì)蔗糖、水楊苷、衛(wèi)矛醇及棉子糖的發(fā)酵力不一致，吲哚＋，MR＋，V－P－，枸櫞酸胺鹽－(IMVC++--)，尿素酶－，硫化氫－，氰化鉀培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)，丙二酸鹽利用－，可使谷氨酸和賴氨酸脫羧基，苯丙氨酸－，氧化酶－，接觸酶＋。＋12

大腸埃希氏菌發(fā)酵多種糖，如葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、山梨醇和丙三醇等；4）抵抗力

中等略強(qiáng)135）抗原性與分類大腸桿菌具有三種主要抗原：

O（菌體）抗原：173種H（鞭毛）抗原：60種K（莢膜）抗原：103種

F（菌毛）抗原：17種K抗原位于細(xì)胞壁外層，根據(jù)K抗原的物理性質(zhì)又可分為L(zhǎng)、A和B三種主要型別。幾乎所有致病性大腸埃希氏菌都具有F（菌毛）抗原。表示大腸桿菌血清型的方式是O138：K88(B)：H12：

（F8

）。

。3致病性

(1)致病因素(2)所致疾病

(1)致病因素：①侵襲力②內(nèi)毒素③腸毒素

①侵襲力大腸桿菌具有K抗原和菌毛：

K抗原：有抗吞噬作用，有抵抗抗體和補(bǔ)體的作用

菌毛：能幫助細(xì)菌粘附于粘膜表面。有侵襲力的菌株可以侵犯腸道表皮層引起炎癥。②內(nèi)毒素大腸桿菌細(xì)胞壁具有內(nèi)毒素的活性：其脂類A是毒性部位

特異多糖有助于細(xì)菌抵抗宿主的防御機(jī)制。14③腸毒素大腸埃希氏菌引起食物中毒的腸毒素有兩種：

a.不耐熱腸毒素(LT)：蛋白質(zhì)，加熱65℃經(jīng)30min即被破壞，促進(jìn)腸粘膜細(xì)胞大量分泌腸液,引起腹瀉；常因生食所致。b.耐熱腸毒素(ST)，ST無免疫性，耐熱，100℃經(jīng)10-20min不被破壞，它也可引起腹瀉。15LT

:heat

labileenterotoxinST:heatstableenterotoxin(2)所致疾?、倌c外感染②腹瀉

①腸外感染泌尿系統(tǒng)感染敗血癥膽囊炎肺炎新生兒或嬰兒腦膜炎等。

16②腹瀉

4種大腸桿菌都可引起腹瀉：

產(chǎn)毒素大腸桿菌--是嬰幼兒及旅游者腹瀉的主要原因；

致病性大腸桿菌--是嬰兒腹瀉的主要原因，嚴(yán)重者可致死；

侵襲性大腸桿菌--主要引起較大兒童和成年人腹瀉，有時(shí)甚至可引起爆發(fā)流行；

出血性大腸埃希氏菌O157--引起的主要臨床癥狀是腹瀉(重者水樣腹瀉)、腹痛、嘔吐，是老幼患者死亡的主要原因。17

4、培養(yǎng)基和試劑4．1乳糖膽鹽發(fā)酵管：按GB／T4789．28--2003中4．9規(guī)定。

(按大腸菌群測(cè)定方法進(jìn)行，取三個(gè)稀釋度，每個(gè)三管：按乳糖發(fā)酵陽性管測(cè)MPN)4．2營(yíng)養(yǎng)肉湯：按GB／T4789．28—2003中4．8規(guī)定。

(前增菌36℃

6h)4．3腸道菌增菌肉湯：按GB／T4789．28--2003中4．18規(guī)定

(增菌，42℃18h)

含膽鹽、煌綠和葡萄糖184．4麥康凱瓊脂：按GB／T4789．28--2003中

4．24規(guī)定。(發(fā)酵乳糖，產(chǎn)生有色菌落)

4．5伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)：按GB／T4789．28—2003中4．25規(guī)定。（36℃

18－24h，分離培養(yǎng)注意乳糖發(fā)酵、不發(fā)酵和遲緩發(fā)酵菌落）

或19E.colionMacConkeyagar:positivelactosefermentation(hotpinkcolonies)andbileprecipitate(hotpink,opaqueagar)/.../DMI_8351/EColiIm.html4．6三糖鐵瓊脂(TSl)：乳糖10g、蔗糖10g和葡萄糖1g按GB／T4789．28--2003中4．26，4．27規(guī)定。（斜面糖發(fā)酵產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸、產(chǎn)氣）

4．7克氏雙糖鐵瓊脂(KI)（上：乳糖，下：葡萄糖）按GB／T4789．28--2003中4．28，2．29規(guī)定。4．8糖發(fā)酵管(乳糖、鼠李糖、木糖和某露醇)：按GB／T4789．28—2003中3．2規(guī)定。（＋）TSl：E.coli或4.6-4.12:生化實(shí)驗(yàn);

20其原理與三糖鐵瓊脂基本相同/fox/enterobact.htm4．9賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基（＋）按GB／T4789．28--2003中3．12規(guī)定。4．10尿素瓊脂(pH7．2)（－）按GB／T4789．28--2003中3．15規(guī)定。4．11氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基：（－）按GB／T4789．28--2003中3．16規(guī)定。4．12蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑

（＋）按GB／T4789。28—2003中3．13規(guī)定。

/.../302labf99/biochem.htmlE.coli

4．13半固體瓊脂動(dòng)力實(shí)驗(yàn)（＋）按GB／T4789．28--2003中4．30規(guī)定。4.14～4.15培養(yǎng)菌毒素測(cè)定用4.14Honda氏產(chǎn)毒肉場(chǎng)：按GB／T4789．28--2003中4．34規(guī)定

(CYCA培養(yǎng)基,)營(yíng)養(yǎng)豐富。4.15Elek氏培養(yǎng)基：按GB／T4789．28—2003中4．35規(guī)定

21或4.16氧化酶試劑：按GB／T4789．28--2003中3．18規(guī)定。（必要時(shí)做，E.coli：－）4.17革蘭氏染色液：按GB／T4789．28--2003中2．2規(guī)定(G-)

Gramstain:E.coli4.18：檢測(cè)血清型用

致病性大腸埃希氏菌診斷血清侵襲性大腸埃希氏菌診斷血清產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌診斷血清出血性大腸埃希氏菌診斷血請(qǐng)。多價(jià)血清－－單價(jià)血清凝集實(shí)驗(yàn)－－強(qiáng)凝集結(jié)果－－定型/UploadFiles/%E8%...

（4.19-4.24:檢測(cè)毒素用）4．19產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌LT和ST酶標(biāo)診斷試劑盒

(LT不耐熱腸毒素，ST耐熱腸毒素）

4．20產(chǎn)腸毒素LT和ST大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株4．21抗LT抗毒素4．22多粘菌素B紙片：300IU,Ф6mm4．230.1％硫柳汞溶液4．242％伊文思藍(lán)溶液225、檢驗(yàn)程序前增菌增菌(增菌，42℃18h)分離培養(yǎng)生化和動(dòng)力實(shí)驗(yàn)23中多少/受損嚴(yán)重賴氨酸＋/－血清分型*腸毒素測(cè)定進(jìn)一步生化實(shí)驗(yàn)24256、腸毒素試驗(yàn)(1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)LT（不耐熱腸毒素）和ST（耐熱腸毒素）

①產(chǎn)毒培養(yǎng)②LT檢測(cè)方法(雙抗體夾心法)③ST檢測(cè)方法(抗原競(jìng)爭(zhēng)法)(2)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)LT(3)乳鼠灌胃試驗(yàn)檢測(cè)ST

LT

:heat

labileenterotoxinST:heatstableenterotoxin26/i?ct=503316480&z=0&tn=baiduimagedetail&word雙抗體夾心法

①產(chǎn)毒培養(yǎng)

將試驗(yàn)菌株和陽性及陰性對(duì)照菌株分別接種于0.6mLCAYE培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。加入20000IU／mL的多粘菌素B0.05mL，于37℃培養(yǎng)1h，4000r／min離心15min，分離上清液，加入0.1%硫柳汞0.05mL，于4℃保存待用。27②LT檢測(cè)方法(雙抗體夾心法)

步驟：抗體包被－洗板－封閉－加樣本-加酶標(biāo)抗體-酶底物反應(yīng)－結(jié)果判定：以酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)492nm下測(cè)定吸光度值OD值，待測(cè)標(biāo)本OD大于陰性對(duì)照3倍以上為陽性，目測(cè)顏色為橘黃色或明顯高于陰性對(duì)照為陽性.28③ST檢測(cè)方法(抗原競(jìng)爭(zhēng)法)步驟：包被抗原（已知）－封閉－（樣品抗原＋單抗）－酶標(biāo)二抗－底物－判定結(jié)果（無色或明顯淡于陰性對(duì)照的為陽性）＋＋＋抗原（已知）＋（樣品抗原＋單抗）＋酶標(biāo)二抗＋底物＋＋＋陽性

陰性－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－29樣品抗原＋單抗（少）(2)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)LT樣品中＋＋－－－對(duì)照板測(cè)試板菌苔＋多粘菌素B紙片

抗毒素沉淀線樣品中出現(xiàn)沉淀線者為陽性30雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果Elek氏培養(yǎng)基(3)乳鼠灌胃試驗(yàn)檢測(cè)ST

處理過的疑似毒素液體灌入乳鼠胃內(nèi)，3－4h麻醉后取出全部腸管，稱重（包括里面的液體）及剩余體重，計(jì)算二者之比，大于0.09的為陽性，0.07－－0.09的為可疑。全部腸管重（包括里面的液體）剩余體重﹥0.09陽性0.07-0.09可疑∠0.07陰性311、免疫磁珠富集菌體，分離培養(yǎng)/system/uploadtypeN/BH13K176MO.jpg

7、快速檢測(cè)方法—另外講１９９９年９月引進(jìn)了Ｏ１５７免疫磁珠分離技術(shù)，提高了分離率；于２０００年向各省疾病控制系統(tǒng)提供我國(guó)自己標(biāo)記的Ｏ１５７免疫磁珠。322、膠體金技術(shù)：大腸桿菌Ｏ１５７特異性單克隆抗體膠體金快速診斷卡－－雙抗體夾心法

首先從國(guó)外進(jìn)口產(chǎn)品是多克隆抗體的膠體金技術(shù)，后又發(fā)展了我國(guó)自己的大腸桿菌Ｏ１５７特異性單克隆抗體膠體金快速診斷卡，修改了分離程序。研究人員將Ｏ１５７快速診斷卡用于糞便標(biāo)本的初篩，減少了８０％-９０％的工作量，且１０分鐘左右即可出結(jié)果，又無須特殊設(shè)備，便于基層推廣。該技術(shù)目前已在我國(guó)大多數(shù)省市的疾病控制系統(tǒng)中使用。33快速斑點(diǎn)滲濾法的基本原理：夾心法測(cè)抗原：固定于膜上的多克隆抗體＋標(biāo)本中待測(cè)抗原＋金標(biāo)記的特異性單克隆抗體顯色。測(cè)試片不能單獨(dú)測(cè)定E.coliO157,像大多數(shù)其他E.conliform培養(yǎng)基一樣,它沒有專門指示是否有任何0157菌株的存在.

AOAC確認(rèn)的方法:

E.coli=49(藍(lán)色菌落帶有氣泡)

Totalcoliform=87(紅色和藍(lán)色菌落帶有氣泡)3、測(cè)試片大腸桿菌/大腸菌群

計(jì)數(shù)測(cè)試片35脂質(zhì)體：在簡(jiǎn)單的試紙檢測(cè)中，抗體附著在脂質(zhì)體外層殼體上，與樣本混合后，就可結(jié)合樣本中的大腸桿菌O157:H7。脂質(zhì)體內(nèi)包含的顯色分子會(huì)將病菌清晰地標(biāo)志出來--樣本液體沿試紙條上升時(shí)，如果樣本液體中含有大腸桿菌O157:H7，試紙就會(huì)變紅。然后，再根據(jù)試紙顏色深淺判斷病菌數(shù)量的多寡：顏色越深，細(xì)菌越多/book/04/image/image009.jpg脂質(zhì)體（liposome）是一種人工膜。在水中磷脂分子親水頭部插入水中，疏水尾部伸向空氣，攪動(dòng)后形成雙層脂分子的球形脂質(zhì)體，直徑25~1000nm不等。脂質(zhì)體可用于轉(zhuǎn)基因，或制備的藥物，利用脂質(zhì)體可以和細(xì)胞膜融合的特點(diǎn)，將藥物送入細(xì)胞內(nèi)部。

脂質(zhì)體（liposome）是一種人工膜。在水中磷脂分子親水頭部插入水中，疏水尾部伸向空氣，攪動(dòng)后形成雙層脂分子的球形脂質(zhì)體，直徑25~1000nm不等。脂質(zhì)體可用于轉(zhuǎn)基因，或制備的藥物，利用脂質(zhì)體可以和細(xì)胞膜融合的特點(diǎn)，將藥物送入細(xì)胞內(nèi)部。

脂質(zhì)體（liposome）是一種人工膜。在水中磷脂分子親水頭部插入水中，疏水尾部伸向空氣，攪動(dòng)后形成雙層脂分子的球形脂質(zhì)體，直徑25~1000nm不等。脂質(zhì)體可用于轉(zhuǎn)基因，或制備的藥物，利用脂質(zhì)體可以和細(xì)胞膜融