T-DM1的毒性和ADC藥物脫靶作用機(jī)制概況T-DM1的毒性和ADC藥物脫靶作用機(jī)制概況T-DM1由美登素類細(xì)胞毒素DM1通過不可裂解硫醚連接子與人源化單克隆抗體曲妥珠單抗偶聯(lián)而成。與HER2結(jié)合后，T-DM1被內(nèi)化進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，并在溶酶體中發(fā)生降解，形成Lys-MCC-DM1復(fù)合物作為效應(yīng)分子，靶向微管蛋白從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在過去的近10年中，T-DM1曾作為HER2陽性晚期乳腺癌的二線標(biāo)準(zhǔn)治療藥物，也是新輔助治療后殘留浸潤性疾病的HER2陽性早期乳腺癌患者的強(qiáng)化輔助治療選擇。血小板減少、肝轉(zhuǎn)氨酶升高和周圍神經(jīng)病變是T-DM1的常見不良反應(yīng)[3]。并且T-DM1在臨床試驗(yàn)中觀察到的主要劑量限制性毒性是血小板減少和肝轉(zhuǎn)氨酶升高[2]。脫靶作用是目前臨床開發(fā)中ADC藥物劑量限制性毒性的主要原因[2]。可能的發(fā)生機(jī)制包括①連接子-載藥不穩(wěn)定導(dǎo)致循環(huán)中載藥過早釋放；②旁觀者效應(yīng)；③正常細(xì)胞通過受體依賴性和非受體依賴性（非特異性內(nèi)吞）機(jī)制攝取/轉(zhuǎn)運(yùn)完整的ADC藥物[4]。雖然正常細(xì)胞對ADC藥物的非靶點(diǎn)依賴性攝取可能是產(chǎn)生脫靶毒性的主要原因之一，但這卻是ADC藥物相關(guān)毒性中研究相對較少的機(jī)制[2]。圖1 正常細(xì)胞攝取ADC藥物或游離載藥的潛在機(jī)制。①靶抗原可能在正常細(xì)胞上表達(dá)，有助于ADC藥物的靶點(diǎn)依賴性攝取。②與IgG抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體，如Fcγ受體(FcγR)、新生兒Fc受體(FcRn)和C型凝集素受體(CLR)也可能有助于正常細(xì)胞中ADC藥物的非靶點(diǎn)依賴性內(nèi)吞/轉(zhuǎn)運(yùn)。③非特異性內(nèi)吞機(jī)制，如巨胞飲或小胞飲也可能導(dǎo)致完整ADC藥物或游離載藥（由于連接子-藥物不穩(wěn)定或胞外蛋白酶活性使得載藥在細(xì)胞外釋放）進(jìn)入細(xì)胞。④游離載藥也可能通過其他機(jī)制進(jìn)入正常細(xì)胞，如被動擴(kuò)散（如果具有膜通透性）、非特異性內(nèi)吞或特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（如果是膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物）介導(dǎo)的攝取。⑤抗原陽性靶細(xì)胞還能夠通過將載藥釋放到局部環(huán)境中介導(dǎo)毒性，隨后被抗原陰性正常細(xì)胞通過被動擴(kuò)散、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的攝取或通過其他非特異性內(nèi)吞機(jī)制攝取，類似于旁觀者效應(yīng)[4]。已知抗體可通過多種機(jī)制以非靶點(diǎn)依賴性方式被正常細(xì)胞攝取，包括Fc受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑（例如，甘露糖受體、FcRn和FcγR受體）、非特異性內(nèi)吞作用和/或ADC藥物分解代謝產(chǎn)物的攝取。理論上，非靶點(diǎn)依賴性攝取可導(dǎo)致ADC藥物通過胞內(nèi)體或溶酶體途徑在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，隨后在正常細(xì)胞中釋放細(xì)胞毒載藥。但是評估非靶點(diǎn)依賴性攝取對ADC藥物總體脫靶毒性特征影響的數(shù)據(jù)非常少。而支持該假設(shè)的最廣泛的證據(jù)來自對T-DM1介導(dǎo)的血小板減少機(jī)制的研究探索[2]。不僅如此，鑒于無論靶蛋白表達(dá)如何，大多數(shù)與微管蛋白抑制劑結(jié)合的ADC藥物的最大耐受劑量(MTD)范圍為2-5mg/kg。為了改善下一代ADC藥物的治療指數(shù)，有必要對脫靶毒性的潛在機(jī)制進(jìn)行更加深入地了解[2]。T-DM1誘導(dǎo)血小板減少的發(fā)生機(jī)制T-DM1誘導(dǎo)血小板減少的發(fā)生機(jī)制血液學(xué)毒性是以奧瑞他汀類（如MMAE、MMAF）、刺孢霉素類、美登素類（如DM1）作為“彈頭”分子的ADC藥物的最常見非靶點(diǎn)依賴性劑量限制性毒性[4]。Uppal等[4,5]研究者通過研究T-DM1介導(dǎo)的血小板減少癥的發(fā)生機(jī)制，支持了FcγR在ADC藥物治療相關(guān)血液學(xué)毒性中的關(guān)鍵作用。既往已有研究者證實(shí)在循環(huán)血小板或骨髓中分化的巨核細(xì)胞（MKs）表面未見HER2表達(dá)，因此預(yù)期這些細(xì)胞中不存在靶點(diǎn)依賴性攝取。Uppal等利用體外實(shí)驗(yàn)和一種新型的人骨髓造血干/祖細(xì)胞分化模型，不僅排除了ADC對成熟血小板的直接作用，同時也揭示了巨核細(xì)胞（骨髓中）表面FcγRIIa介導(dǎo)的T-DM1內(nèi)化和由此產(chǎn)生的細(xì)胞毒性（細(xì)胞骨架破壞）是血小板生成減少的機(jī)制。使用FcγRII阻斷抗體（抗CD32抗體）或使用不能結(jié)合FcγR的Fcγ突變體T-DM1（攜帶D265A和N297A突變的T-DM1-DANA）可顯著減少巨核細(xì)胞中的T-DM1內(nèi)化。此外，僅觀察到T-DM1和含有DM1的對照ADC藥物對巨核細(xì)胞產(chǎn)生影響，而曲妥珠單抗盡管也能被巨核細(xì)胞內(nèi)化，但是并無不良影響，這表明T-DM1對巨核細(xì)胞造成損傷導(dǎo)致的血小板減少是由載藥DM1介導(dǎo)的，但是需要T-DM1抗體上的Fc結(jié)構(gòu)域與FcγRIIa相互作用才能發(fā)生內(nèi)化?？傮w而言，研究者得出結(jié)論，F(xiàn)cγRIIa（至少部分）有助于T-DM1結(jié)合和內(nèi)化的機(jī)制介導(dǎo)了巨核細(xì)胞分化受損，并最終導(dǎo)致血小板減少的發(fā)生。但是，由于研究數(shù)據(jù)不支持內(nèi)化T-DM1與溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP1在巨核細(xì)胞中的共定位，因此本研究仍不清楚ADC/FcγRIIa復(fù)合物如何內(nèi)化以及T-DM1的效應(yīng)分子Lys-MCC-DM1如何釋放到巨核細(xì)胞的微管中[3]。與該研究報告的結(jié)果不同，Thon等[6]研究者認(rèn)為T-DM1誘導(dǎo)的血小板減少癥是通過獨(dú)立于HER2或Fc受體的機(jī)制發(fā)生的，這是基于Thon等將小鼠胎肝細(xì)胞培養(yǎng)物和成熟巨核細(xì)胞與T-DM1、5B6-DM1（非特異性人源化抗體偶聯(lián)物）、曲妥珠單抗（單獨(dú)抗體）或溶媒對照共同孵育?；诰藓思?xì)胞/血小板不表達(dá)HER2受體，且小鼠不含人IgG的FcRIIA的事實(shí)。盡管曲妥珠單抗是一種直接針對HER2胞外域的人源化單克隆抗體，但觀察到5B6-DM1在小鼠造血干細(xì)胞和巨核細(xì)胞培養(yǎng)物中的作用與T-DM1相似，表明T-DM1的攝取并不依賴于HER2和FcRIIA。此外，該研究還表明T-DM1可破壞巨核細(xì)胞和血小板中的微管組織。同時Thon也支持了Uppal的觀點(diǎn)，即曲妥珠單抗單藥對巨核細(xì)胞分化或血小板的生成沒有影響，血小板減少癥源自載藥DM1引起的微管抑制。不僅如此，雖然Uppal等證實(shí)了阻斷T-DM1與FcγRIIa受體的相互作用可顯著降低T-DM1內(nèi)化，但并不能完全阻斷巨核細(xì)胞對T-DM1的攝取或細(xì)胞毒性，提示其他機(jī)制（如非特異性內(nèi)吞）也可能導(dǎo)致血小板減少。Zhao等[7]研究者發(fā)表的報道很好地支持了這一觀點(diǎn)，該報告研究了AGS-16C3F[靶向ENPP3(外切核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員-3)的單抗，通過不可裂解連接子與MMAF偶聯(lián)而成的ADC藥物）]和T-DM1，使用與Uppal研究中相似的體外巨核細(xì)胞細(xì)胞分化平臺誘導(dǎo)血小板減少癥。AGS-16C3F與T-DM1相似，對成熟血小板無直接作用，在循環(huán)血小板或其前體巨核細(xì)胞上也未檢測到ENPP3（靶抗原）表達(dá)。但與Uppal相反，Zhao等研究者認(rèn)為ADC藥物在巨核細(xì)胞中的非靶點(diǎn)依賴性巨胞飲及其分化抑制作用在ADC藥物誘導(dǎo)的血小板減少癥中發(fā)揮著作用[4,7]。ADC藥物除了通過FcγR介導(dǎo)和/或巨胞飲介導(dǎo)的攝取過程進(jìn)入巨核細(xì)胞外，其他機(jī)制如外周破壞或循環(huán)血小板的清除/隔離增加也可能導(dǎo)致ADC藥物誘導(dǎo)的血小板減少。人體血小板的代謝周期在正常情況下為9-11天，然后通過不同機(jī)制清除，包括去唾液酸化，暴露潛在的半乳糖基團(tuán)（被Ashwell-Morrell受體識別）以清除肝細(xì)胞和免疫介導(dǎo)（抗體或T細(xì)胞依賴性）機(jī)制。了解ADC藥物治療后血小板動力學(xué)的變化可能有助于區(qū)分由于生成減少還是外周破壞或清除導(dǎo)致的血小板減少。若血小板計數(shù)快速（急性）下降（<5-7天），表明外周血中血小板破壞加速或隔離在遠(yuǎn)端損傷部位，而不是骨髓生成減少。例如，刺孢霉素類偶聯(lián)ADC藥物在食蟹猴中誘導(dǎo)產(chǎn)生的血小板減癥，被證明與FcγR介導(dǎo)或巨胞飲介導(dǎo)的巨核細(xì)胞攝取無關(guān)。而這種主要在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSEC)中的肝毒性與肝竇間隙中的血小板隔離相關(guān)，從而導(dǎo)致血小板減少的發(fā)生[4]。T-DM1誘導(dǎo)肝毒性的發(fā)生機(jī)制T-DM1誘導(dǎo)肝毒性的發(fā)生機(jī)制HER2依賴性途徑肝毒性是T-DM1治療的黑框警告之一，可能導(dǎo)致肝酶、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)嚴(yán)重升高[3]。為了探索T-DM1誘導(dǎo)肝毒性的分子機(jī)制，Endo等[8]研究者建立了體外和體內(nèi)模型，如永生化人肝細(xì)胞，與T-DM1治療敏感的HER2陽性乳腺癌細(xì)胞系相比，如SKBR-3和BT-474，其HER2表達(dá)水平較低。結(jié)果表明，T-DM1可能通過HER2依賴性攝取途徑引起肝毒性。并且研究者還發(fā)現(xiàn)，由T-DM1介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷可被促炎細(xì)胞因子TNF-α進(jìn)一步加強(qiáng)，這是因?yàn)門-DM1引起的線粒體外膜破裂，引發(fā)了線粒體依賴性凋亡[9]。ADC藥物誘導(dǎo)的靶點(diǎn)依賴性肝毒性在吉妥珠單抗（GO，抗CD33單抗與刺孢霉素衍生物偶聯(lián)而成的ADC藥物）中也十分典型，F(xiàn)DA于2000年批準(zhǔn)GO用于治療急性髓系白血病(AML)，并于2010年將其撤市，原因是批準(zhǔn)后的研究未顯示患者的生存期較單獨(dú)化療有所改善，且存在安全性問題，包括顯著的肝毒性。Maniecki等證明CD33受體廣泛分布于肝組織和肝細(xì)胞上。由此認(rèn)為GO特異性靶向表達(dá)CD33的肝細(xì)胞與肝毒性有關(guān)[3]。CKAP5依賴性途徑除了T-DM1誘導(dǎo)的HER2依賴性肝毒性外，Endo等[9]還注意到DM1與非靶向IgG偶聯(lián)也可在體外引起劑量依賴性細(xì)胞生長抑制。Endo等假設(shè)HER2非依賴性攝取機(jī)制也可能參與T-DM1誘導(dǎo)的肝毒性。為了尋找能參與T-DM1誘導(dǎo)肝毒性的新靶點(diǎn)分子，使用T-DM1作為誘靶，并在細(xì)胞培養(yǎng)皿中與人和小鼠肝細(xì)胞共同孵育，以便針對能與T-DM1結(jié)合的細(xì)胞表面分子進(jìn)行免疫沉淀分析。該研究篩選出一個分子量為230kDa的蛋白可與T-DM1特異性結(jié)合，但不與曲妥珠單抗或?qū)φ誌gG結(jié)合[9]。該蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定為細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白5（CKAP5，也稱為ch-TOG或XMAP215），是XMAP215/Dis1家族的成員，通過與微管蛋白結(jié)合，在微管聚合調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。關(guān)于CKAP5的組織分布，基于人類蛋白質(zhì)圖譜（teina/），CKAP5在多種人體組織中廣泛表達(dá)[3]。Endo等進(jìn)一步證實(shí)CKAP5與T-DM1的結(jié)合是通過T-DM1的DM1部分介導(dǎo)的，并證明DM1和CKAP5之間的相互作用發(fā)生在細(xì)胞表面，與T-DM1的抗體部分曲妥珠單抗無關(guān)[9]。數(shù)據(jù)顯示，與細(xì)胞表面的CKAP5結(jié)合后，T-DM1開始損傷細(xì)胞膜，隨后鈣流入肝細(xì)胞，導(dǎo)致微管聚合破壞和細(xì)胞凋亡[9]。在該研究中，MMAE偶聯(lián)的維布妥昔單抗未能與CKAP5結(jié)合，也未引起細(xì)胞膜損傷和肝細(xì)胞凋亡[9]。Endo等確定了在HER2表達(dá)水平較低的正常細(xì)胞/組織中，ADC藥物(T-DM1)介導(dǎo)的非靶點(diǎn)(HER2)依賴性細(xì)胞毒性的新機(jī)制。此外，Endo等還發(fā)現(xiàn)，這種新機(jī)制也可能與其他DM1和DM4偶聯(lián)ADC藥物誘導(dǎo)的肝毒性相關(guān)，這是因?yàn)檠芯恐杏^察到非特異性ADC藥物分子（α-CD22-DM1α-gD-DM4）CKAP5結(jié)合并誘導(dǎo)了肝細(xì)胞中微管的紊亂[9]。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，CKAP5可被認(rèn)為是美登素類（DM1或DM4）偶聯(lián)ADC藥物介導(dǎo)的脫靶毒性的細(xì)胞靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步的臨床前和臨床研究。圖1總結(jié)了T-DM1通過HER2和CKAP5依賴性途徑誘導(dǎo)肝毒性的機(jī)制。圖1T-DM1通過HER2和CKAP5依賴性途徑誘導(dǎo)肝毒性的機(jī)制。①HER2依賴性途徑：T-DM1與腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的HER2相互作用后，T-DM1/HER2復(fù)合物內(nèi)化，隨后在溶酶體內(nèi)降解并釋放Lys-MCC-DM1至靶細(xì)胞微管，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。HER2依賴性通路是T-DM1在HER2陽性腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)肝毒性的主要機(jī)制。②CKAP5依賴性途徑：T-DM1(DM1)在肝細(xì)胞表面與CKAP5特異性結(jié)合后，T-DM1開始損傷細(xì)胞膜，隨后鈣流入肝細(xì)胞內(nèi)部。肝細(xì)胞胞漿中鈣濃度升高引起微管網(wǎng)絡(luò)紊亂，從而導(dǎo)致細(xì)胞