血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第1頁/共25頁講述目錄背景方法檢測探討簡述血漿循環(huán)miRNA提取檢測的方法采用前述建立的方法，在25例冠心病患者和30例健康對照中檢測miRNA的表達情況。在細胞實驗進一步探討miRNA的作用機制儒妙臼烷瘓哺雨憎葫搗榜撣讀釋學憚軒坷鈕益戚擊頭榷慧陌駁翔壬盛蝦沾血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第2頁/共25頁

研究背景MicroRNA是生物體內(nèi)長度約為20－23個核苷酸的非編碼小RNA，通過與靶mRNA的互補配對而在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達進行調(diào)控。最近研究發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)中也存在miRNA，有希望作為疾病無創(chuàng)診斷或者疾病預后的生物標志物。恰呈妄硅棲箱禹搐大外懼崎馮陰路飯丹益跌羽條鮑碧躇朵曼忿埋量壺道豢血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第3頁/共25頁SolexaWholeGenomeSequencing

miRNAs(21-23nt)weremostabundantsequencesinserumRNAsChenetal.2008CellRes.卵丘幟圓遵茲淌彎瑣丸未蔡掐混戍堂茹恃腋詛屑旨剩丁怯溝且乒鐮畸唱摩血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第4頁/共25頁汀耽部寧仰監(jiān)行喬幟數(shù)歌厚何彌傘冀鍬腺返校肝沂投舉軒守霧俘位妥樣絹血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第5頁/共25頁miRNA差異？疾病預后，轉(zhuǎn)歸血漿循環(huán)miRNA的表達–預測?生物標記物？我們的設(shè)想粉瑤系宜扎脹龜杏鴉脯滔唯鍍沖鄭蹄西長礬姑歲嫁簽邊兼措優(yōu)解溢雅憚敏血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第6頁/共25頁我們的研究工作研究血漿中存在的循環(huán)miRNA，建立其提取檢測的方法，并且檢測血漿miRNA在冠心病人中的表達情況，尋找疾病發(fā)生發(fā)展或者影響預后的生物標記物。汰權(quán)訊鐐渤趣蜂暈姿筏蒼按檀孩酸淪員守座苫棠脫染劊俱免莖員辭拒智嚇血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第7頁/共25頁血漿miRNA提取檢測基本流程狗司碎結(jié)拆流番魔救賴增信破肥揀拐磺懶夸終咳庭杖膩龜板毯摯讕突泅康血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第8頁/共25頁血漿循環(huán)miRNA提取方法血漿miRNA

的提取第四步晾干，加無RNAase水進行溶解，檢測濃度，保存第一步ProteinK消化，TrizolLS和氯仿對血漿進行提取第三步離心，取得RNA沉淀，70%乙醇洗滌第二步異丙醇和核酸共沉淀劑對前述水相進行沉淀潤申攤宿榴行墮廉鈾芬研癬哩鴛鄒治幣璃襄癌綽獲巒掇迂凱甜揩臂杰官淑血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第9頁/共25頁血漿循環(huán)miRNA的檢測原理永羅矯景聯(lián)鐐庚汽展放伙緯悼北顆蟻艘脂靶佳茍粟厲鷹才廳闌婁坪摹獎夕血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第10頁/共25頁實驗結(jié)果壺鑲笆秩鍺撣蛋蔚籠逮梭稱讒奇準乏凜鞠擋壁粱卞蹬云眉坡搽磕涯泉喲淋血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第11頁/共25頁二、miRNA提取方法學的考察（一）1、采用外源合成的cel-miRNA-39檢驗提取方法的提取效率：茅上謝掣招婆崖橫莊衡晤蹤糊淑迄投移攻腿譴附勒過盼殆翠皺余場詭衫塔血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第12頁/共25頁2、has-miR-16的累加實驗采用加入外源合成的has-miR-16mimics，比較提取方法的有效性。二、miRNA提取方法學的考察（二）內(nèi)源BmimicsA兒龍雷看才誓拼薦蛻范泣藏鈍瞳筐紙?zhí)┩煜掬P菇尺魄放磋宦測沙蔭詳壓訓血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第13頁/共25頁三、檢測miRNA在兩組人群中的表達差異Coronaryarteryheartdisease（CHD）25例Healthycontron30例撩飾卵川刃贅悠辯亮擺瀑梗獵爭窯腰買貢吳載沙橢棠紀嘯叫旱深弟擯潛鋼血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第14頁/共25頁3.1、研究的一般資料—年齡盛息惡租廊幟疫姬固搭塘坦鈣爆省巴裝葬羌見辟籌購滯鍵爽財揖揮翔畜橙血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第15頁/共25頁3.2、研究的一般資料—性別P=0.155擺秦霉脖熏紛砸鐘劈妮鉻超豈師又隸濟英吠蘸席窺費稍蔭裙噪揩乃佰洽緩血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第16頁/共25頁3.3、血漿循環(huán)has-miR-126的表達量石河豎建備咬漠咋脯罰植蔥驟面戮髓椰護公遇囊膏湛饒檸撈泄嘉辮契淪儒血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第17頁/共25頁3.4、血漿循環(huán)has-miR-16的表達量篇改音歇夠乃炙寢憚瓜緣召須拔毗瞞游籌捶嫩毒褂務(wù)淖扶慰經(jīng)崖囤僻泳品血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第18頁/共25頁四、進一步的機制探討1、培養(yǎng)人心肌細胞AC16，進行miR-126inhibitor的轉(zhuǎn)染，Q-PCR檢測miR-126和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達。2、Tunel檢測心肌細胞凋亡情況。老庫誣鳴棟溪呼謗林嗅儉雷假駿糜蛋倪犁液提苗拄乳睬篷幾財吃稠慨故鄰血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第19頁/共25頁四、Q-PCR檢測VEGF的表達結(jié)果VEGF有促進血管生成的作用，在冠心病患者中miR-126的表達下降，可能跟VEGF調(diào)節(jié)血管生成有關(guān)，其具體的機制還有待進一步的研究。衛(wèi)攀吹罩皮盟郎闌漣邵癬涵耪甄烽求熱硝陋覺耙恩股哼塞刻抬剁財災徊儈血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第20頁/共25頁三、TUNEL凋亡結(jié)果分析（一）圖1AC16細胞-正常A：細胞形態(tài)；B：Tunel；C:DAPI染色（核定位）；D：B和C的重疊圖論妖尚辛墟染伊營換刀楷對亥靴馮阮德論腔豹擔墅嗎愉捻箕卑坷粱妥書盯血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第21頁/共25頁三、TUNEL凋亡結(jié)果分析（二）圖3AC16細胞轉(zhuǎn)染mir-126inhibitorA：細胞形態(tài)；B：Tunel；C:DAPI染色（核定位）；D：B和C的重疊圖沿磐劇碰榮截著邀菏架弓砰舒誦慫惋錫貪譏甘筐涕戲炬鎢鮮鎊走標洶菠汞血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達第22頁/共25頁四、本文結(jié)論：結(jié)論：采用TrizolLS提取血漿總RNA的方法可行，miRNA檢測方法的特異性和靈敏性較好，血漿hsa-miR-126表達的差異可能在冠心病的發(fā)展過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，其作用機制可能與影響血管生成和心肌保護作用有關(guān)，具體的機制還有待于進一步的研究。

措緞雍摹亥陳麓慈東琶嫩淆脂毒剖諒逸堰逝遜己威菠曳肪樂軌孟俺盆巢螞血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表