大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備第1頁(yè)，共13頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^本實(shí)驗(yàn)，掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備的方法和技術(shù)。第2頁(yè)，共13頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二、實(shí)驗(yàn)原理感受態(tài)細(xì)胞制備:所謂感受態(tài)是指受體細(xì)胞處于容易吸收外源DNA的一種生理狀態(tài)，可以通過物理與化學(xué)方法誘導(dǎo)形成，也可以自然形成，在基因工程技術(shù)中通常采用誘導(dǎo)的方法。用于轉(zhuǎn)化的受體菌細(xì)胞一般是限制-修飾系統(tǒng)（Restriction-Modification）缺陷的變異株，以防止對(duì)導(dǎo)入的外源DNA的切割，用符號(hào)R-M-表示。第3頁(yè)，共13頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二、實(shí)驗(yàn)原理其基本原理是：細(xì)菌處于0℃的CaCl2低滲溶液中，會(huì)膨脹成球形，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，轉(zhuǎn)化混合物中的質(zhì)粒DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，經(jīng)過42℃短時(shí)間的熱激處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖，在選擇培養(yǎng)基上可獲得所需的轉(zhuǎn)化子。第4頁(yè)，共13頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

三、實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備1、用品與與儀器：超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、移液器、微型離心管等、臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)、冰箱、制冰機(jī)等；1.5mL與0.5mLEppendorf管、tip頭、燒杯、量筒。

鑷子、試管三角瓶、玻璃涂棒、酒精燈、無菌牙簽、吸水紙，一次性塑料手套等；E.coliDH5α受體菌(R-M-)，pGEX-4T-2質(zhì)粒(Ampr)。第5頁(yè)，共13頁(yè)，2023年，2月20日，星期一三、實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備2、試劑：LB培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，瓊脂粉15g/L（固體培養(yǎng)基），用10mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0，高壓滅菌；氨芐青霉素貯存液：濃度50-100mg／mL；含有抗菌素的LB平板培養(yǎng)基：將配置好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后，冷卻到60度左右，加入氨芐青霉素（終濃度為50μg／mL濃度50-100μg／mL）；第6頁(yè)，共13頁(yè)，2023年，2月20日，星期一超凈工作臺(tái)第7頁(yè)，共13頁(yè)，2023年，2月20日，星期一恒溫培養(yǎng)箱第8頁(yè)，共13頁(yè)，2023年，2月20日，星期一制冰機(jī)第9頁(yè)，共13頁(yè)，2023年，2月20日，星期一高速冷凍離心機(jī)和超速離心機(jī)等第10頁(yè)，共13頁(yè)，2023年，2月20日，星期一四、實(shí)驗(yàn)操作1、從新活化的E.coliDH5α平板上挑取一單菌落，接種于3～5mlLB液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(12h左右)；

2、將該菌懸液以1:100～1:50轉(zhuǎn)接于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后，每隔20～30min測(cè)一次OD600，至OD600為0.3～0.5時(shí)停止培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)裝到1.5mL離心管中；

3、培養(yǎng)物于冰上放置20min；

4、0～4℃，4000g離心10min，棄去上清液，加入1mL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞,冰浴20分鐘；第11頁(yè)，共13頁(yè)，2023年，2月20日，星期一四、實(shí)驗(yàn)操作

5、0～4℃，

4000g離心10min，倒凈上清培養(yǎng)液，再用1.0mL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴20min；

6、0～4℃，

4000g離心10min，棄去上清液，加入100μL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液；

7、制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，如果在4℃放置12～24h，其轉(zhuǎn)化效率可以增高4～6倍；也可加入占總體積15％左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中，置于-7