遺傳實驗人外周血培養(yǎng)與染色體制備第1頁/共28頁一、實驗目的：1.學習外周血淋巴細胞懸浮培養(yǎng)的原理和方法；2.利用培養(yǎng)后進行分裂的細胞制備人類染色體標本；3.利用人類染色體核型分析軟件進行核型分析。第2頁/共28頁二、實驗原理：

1、植物血凝素的作用

外周血中的淋巴細胞幾乎都是處在G0或G1期，一般情況下是不分裂的。當在培養(yǎng)基中加入植物血凝素(PHA)時，這種小淋巴細胞受到刺激后轉化為淋巴母細胞，進而開始進行有絲分裂。第3頁/共28頁

2、秋水仙素的作用：

秋水仙素(colchicine)可以抑制細胞紡錘體的形成，使處在分裂的細胞停留在中期。因此利用秋水仙素處理可以獲得許多同步的中期分裂細胞。使用秋水仙素處理會引起染色體在一定程度上的收縮，因此在處理時間和濃度上要合適。第4頁/共28頁

3、低滲的原理：

徐道覺(T.C.Hsu)等于1952年發(fā)現(xiàn)在固定細胞之前使用低滲液進行處理，可以使細胞的核膜吸水膨脹，滴片后細胞破裂，染色體分散開來，在顯微鏡下易于觀察和統(tǒng)計，染色效果也明顯提高。這種技術被廣泛采用后，使人類染色體分析技術得到了發(fā)展。第5頁/共28頁4、核型和帶型：核型(karyotype)：

是指染色體組在有絲分裂中期的表型,是染色體數(shù)目、大小、形態(tài)特征的總和。在對染色體進行測量計算的基礎上,進行分組、排隊、配對,并進行形態(tài)分析的過程叫核型分析。將一個染色體組的全部染色體逐條按其特征畫下來，再按長短、形態(tài)等特征排列起來的圖稱為核型模式圖，它代表一個物種的核型模式。第6頁/共28頁帶型（bandingpattern）

即染色體帶型。借助細胞學的特殊處理程序，使染色體顯現(xiàn)出深淺不同的染色帶。染色帶的數(shù)目、部位、寬窄和著色深淺均具有相對穩(wěn)定性，所以每一條染色體都有固定的分帶模式，即稱帶型。常用的顯帶技術所顯示的帶有Q帶、G帶、C帶、R帶、T帶等。就每一種分帶技術而言，每一染色體的帶型是高度專一和恒定的。第7頁/共28頁三、實驗用具及試劑：實驗儀器及用具：恒溫培養(yǎng)箱、離心機、恒溫水浴箱、冰箱、顯微鏡、顯微數(shù)碼攝像系統(tǒng)、染色體分析儀；培養(yǎng)瓶、注射器、微量移液器、槍頭、吸管、離心管(10ml)、載玻片、燒杯、量筒。.第8頁/共28頁2.實驗試劑：

外周血淋巴細胞培養(yǎng)基

2%碘酒

75%酒精

20μg/ml秋水仙素

0.075mol/LKCl溶液甲醇冰醋酸

Giemsa原液

1/15mol/L磷酸緩沖液

第9頁/共28頁四、實驗步驟：1、采血：將皮膚常規(guī)消毒后靜脈采血約0.5ml。2、種血及培養(yǎng)：將采到的血樣立即接種到培養(yǎng)瓶內，每個培養(yǎng)瓶接28或30滴（約0.5ml），輕輕搖勻后將培養(yǎng)瓶放在37℃溫箱中培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)過程中，每天應輕輕搖動兩次培養(yǎng)瓶。

3、秋水仙素處理：在終止培養(yǎng)前2-3小時，向培養(yǎng)瓶中加20μg/ml的秋水仙素3滴，輕輕搖勻后繼續(xù)培養(yǎng)到72小時。第10頁/共28頁4、制片：（1）離心：從溫箱中取出培養(yǎng)瓶，用吸管將培養(yǎng)液轉入10ml的刻度離心管內。2000轉/分，離心10分鐘。（2）低滲：棄去上清液。加入37℃預熱的0.075mol/LKCl低滲液8ml，用吸管輕輕吹打勻，放在37℃恒溫水浴中40分鐘。(此時配固定液：甲醇225ml+冰醋酸75ml)2000轉/分，離心10分鐘。（3）預固定：棄去上清液，在離心管中加入現(xiàn)配的預溫的甲醇-冰醋酸(3:1)固定液約1ml，輕輕混勻,室溫固定5分鐘。第11頁/共28頁（4）再次離心：2000轉/分離心10分鐘。（5）第一次固定：棄上清液，加入固定液約8ml，立即用吸管吹打使之成細胞懸液，室溫固定20分鐘。2000轉/分離心10分鐘。（6）第二次固定：同第一次固定。（7）棄上清液，加入固定液0.5ml，用吸管吹打使均勻后制成細胞懸液。用封口膜封口，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

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（8）滴片：在30-40cm高處將細胞懸液滴在預冷的載玻片上，注意動作應迅速，避免載片升溫。（9）染色：用10%吉姆薩染液扣染30分鐘，染色結束后用清水將浮色沖去，干燥后即可進行鏡檢。（10）照相：在顯微鏡下尋找分散較好的分裂相(核型)，再置于顯微照相儀下拍攝照片，并保存。（11）核型分析：應用核型分析軟件，進行染色體核型分析。第13頁/共28頁第14頁/共28頁核型分析儀及核型分析第15頁/共28頁五、注意事項:

1、秋水仙素處理時間過長，分裂細胞多，染色體短??；反之，則少而細長。都不宜觀察形態(tài)及計數(shù)。故秋水仙素的濃度及時間要準確掌握。

2、低滲使紅細胞膜破裂，淋巴細胞膨脹，低滲處理濃度及時間要適當。且低滲后混勻細胞一定要輕，否則引起膜破裂、染色體散失。

3、離心前配平，離心速度過高，細胞團不易打散；反之，細胞易丟失。

4、固定液應在使用前臨時配制。

5、載玻片一定要潔凈，否則染色體分散不好。第16頁/共28頁六、實驗結果與分析：

染色體核型分析：人類每個體細胞有46條染色體，22對常染色體和一對性染色體，男性為46，XY；女性為46，XX。第17頁/共28頁A組（No.1～3）：是最大的一組染色體，它們的著絲粒在中部或幾乎在中部，為中部著絲粒染色體；B組（N0.4～5）：為兩對大的亞中部著絲粒染色體，它們有明顯的長臂和短臂；C組（N0.6～12+X）：為中等大小的亞中部著絲粒染色體，它們大小相差不多，X染色體大小介于期間，一般難以區(qū)分；D組（N0.13～15）：為中等大小的近端著絲粒染色體，它們的一個重要形態(tài)特征是隨體，隨體是一對著色很深的小球，處于短臂的末斷，隨體與短臂之間的區(qū)域很少著色；

人類染色體分組第18頁/共28頁E組（N0.16～18）：包括一對中著絲粒染色體（16）和兩對亞中著絲粒染色體（17、18）；F組（N0.19～20）：為兩對小的中部著絲粒染色體；G組（N0.21～22+Y）：為最小的一組近端著絲粒染色體，在N0.21～22的短臂上可見隨體。Y染色體常呈現(xiàn)異固縮狀態(tài)，著色更深，可以識別。

人類染色體核型分析結果

第19頁/共28頁重要參數(shù)：（1）染色體的相對長度（2）臂比率（3）著絲點指數(shù)第20頁/共28頁第21頁/共28頁七、作業(yè)及思考題：1、將分散良好的標本進行顯微照相；2、觀察人類染色體的形態(tài)、結構特點；3、對比男性和女性的染色體標本，比較異同；4、總結做好本實驗的關鍵因素。第22頁/共28頁八、參考文獻：醫(yī)學遺傳學基礎與臨床.程在玉，倫玉蘭.山東：青島出版社，1993.遺傳學實驗教程.王建波，方呈祥等編.武漢：武漢出版社，2004.外周血培養(yǎng)染色體失敗的原因分析.