遺傳病的診斷醫(yī)學(xué)醫(yī)藥第1頁(yè)/共61頁(yè)

臨癥

診斷

Whatwewillstudy？Segment2

Segment1癥狀前診斷Segment3

出生前診斷第2頁(yè)/共61頁(yè)Segment1臨癥診斷

是醫(yī)務(wù)工作者根據(jù)已經(jīng)出現(xiàn)癥狀的患者和各種臨床表現(xiàn)進(jìn)行分析，并進(jìn)行疾病的診斷和遺傳方式的判斷。

病史采集家族史：雙方家族成員中有無(wú)遺傳病史?；橐鍪罚菏欠駥儆诮H婚配，婚齡，婚次，配偶健康狀況，生活習(xí)慣等。生育史：生育年齡，胎次，孕期病史，有無(wú)流產(chǎn)史、死產(chǎn)、早產(chǎn)、難產(chǎn)、產(chǎn)程情況，有無(wú)接觸過(guò)有毒物質(zhì)或電力輻射。1.病史、癥狀和體征臨癥診斷第3頁(yè)/共61頁(yè)例智力低下黃疸白內(nèi)障肝脾腫大智力發(fā)育不全毛發(fā)黃＋腐臭味苯丙酮尿癥

？半乳糖血癥？??面似滿月生長(zhǎng)緩慢哭聲象貓叫貓叫綜合癥？?癥狀與體征第4頁(yè)/共61頁(yè)2.系譜分析系譜分析（pedigreeanalysis)從先證者入手，盡可能多地調(diào)查其親屬的患病情況。這有助于遺傳病與非遺傳病的區(qū)別、單基因病與多基因病的區(qū)別。建立系譜時(shí)的注意事項(xiàng)：主訴的完整性；特殊情況的存在；癥狀和體征檢查的完整性；遺傳異質(zhì)性的存在；不完全外顯與延遲外顯的存在；遺傳印記以及動(dòng)態(tài)突變的存在等。第5頁(yè)/共61頁(yè)遺傳病診斷中的注意事項(xiàng)孟德?tīng)柺竭z傳病

是指符合孟德?tīng)柺竭z傳特征，通常為單基因病。被分為AD、AR、XD、XR和Y連鎖遺傳等幾種類型。系譜分析對(duì)這類疾病的分析十分有用，但要注意遺傳異質(zhì)性、外顯不全以及延遲顯性等造成的臨床假象。非孟德?tīng)柺竭z傳病包括線粒體病和多基因病。線粒體基因突變所致的遺傳病是母系遺傳,主要表現(xiàn)為晚發(fā),并進(jìn)行性加重。多基病是常見(jiàn)疾病，有家族聚集現(xiàn)象，但非孟德?tīng)栠z傳。具有特殊遺傳方式的疾病1.遺傳印記2.動(dòng)態(tài)突變第6頁(yè)/共61頁(yè)染色體熒光原位雜交(FISH)性染色質(zhì)檢查染色體檢查——

核型分析3.細(xì)胞遺傳學(xué)檢查第7頁(yè)/共61頁(yè)誰(shuí)應(yīng)進(jìn)行染色體檢查?智力發(fā)育不全生長(zhǎng)遲緩或伴有其他先天畸形者；夫婦中有染色體異常如平衡易位，嵌合體等；家族中已發(fā)現(xiàn)染色體異?；蛳忍旎蝹€(gè)體；多發(fā)性流產(chǎn)的婦女及其丈夫；原發(fā)性閉經(jīng)和男女不孕癥者；34歲以上的高齡孕婦；有兩性內(nèi)外生殖器畸形者。第8頁(yè)/共61頁(yè)染色體檢查第9頁(yè)/共61頁(yè)性染色質(zhì)

檢查X小體Y小體推測(cè)核型？疾病0210001245,XO47,XXY47,XYY性腺發(fā)育不全癥XXX性腺發(fā)育不全癥先天性睪丸發(fā)育不全癥XYY型綜合癥1248,XXYY47,XXXXXYY型綜合癥第10頁(yè)/共61頁(yè)X染色體Y染色體13號(hào)染色體18號(hào)染色體21號(hào)染色體第11頁(yè)/共61頁(yè)13號(hào)染色體21號(hào)染色體第12頁(yè)/共61頁(yè)4.生化檢查

疾病名稱檢查的酶材料

白化病酪氨酸酶毛囊

苯丙酮尿癥苯丙酮氨酸羥化酶肝

半乳糖血癥半乳糖磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶紅細(xì)胞

DMD

肌酸磷酸激酶血清該方法適用于分子病，先天性代謝缺陷等遺傳病。第13頁(yè)/共61頁(yè)5.基因診斷運(yùn)用分子生物學(xué)方法檢測(cè)患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平的變化而作出或輔助臨床診斷的技術(shù)，稱為分子診斷，又叫基因診斷?；蛟\斷的材料包括：DNA，RNA與蛋白質(zhì)。第14頁(yè)/共61頁(yè)基因診斷的基本原理基因診斷的基本途徑基因診斷的常用技術(shù)

Southern印跡雜交聚合酶鏈反應(yīng)多態(tài)性連鎖分析單鏈構(gòu)象多態(tài)性第15頁(yè)/共61頁(yè)加熱加堿變性緩慢降溫復(fù)性或退火基因診斷原理第16頁(yè)/共61頁(yè)基因診斷的基本途徑直接診斷是直接檢測(cè)致病基因本身的異常，適用于已知基因異常的疾病診斷。2.間接診斷當(dāng)致病基因已知而異常未知時(shí)，或致病基因也未知，可通過(guò)對(duì)受檢者及其家系進(jìn)行連鎖分析，以推斷前者是否獲得了帶致病基因的染色體。第17頁(yè)/共61頁(yè)核苷酸探針（nucleicacidprobe)或基因探針是指一段被標(biāo)記了的、特定的核苷酸序列(DNA/RNA)，用于雜交篩查鑒定被測(cè)DNA或RNA分子?；蛱结?lè)N類1.基因組DNA探針2.cDNA探針3.寡核苷酸探針4.RNA探針探針的特性1.應(yīng)帶有標(biāo)記2.應(yīng)用探針應(yīng)為單鏈3.具有高度特異性4.探針的序列應(yīng)選擇基因編碼序列一、分子雜交相關(guān)技術(shù)第18頁(yè)/共61頁(yè)探針標(biāo)記物標(biāo)記探針靶核酸雜交體第19頁(yè)/共61頁(yè)限制性核酸內(nèi)切酶

限制性核酸內(nèi)切酶能特異地識(shí)別和切割特異的核苷酸序列，將雙鏈DNA切成較小的片段。每種限制酶識(shí)別和切割的通常為4-6個(gè)核苷酸序列,稱為限制性位點(diǎn)或切點(diǎn)。限制酶切割雙鏈DNA的方式有兩種，產(chǎn)生的末端也有兩種：1.是交錯(cuò)切割，即兩條鏈的切點(diǎn)不在同一水平而是相隔數(shù)個(gè)堿基，故斷口產(chǎn)生兩小段自身互補(bǔ)的單鏈，這種末端容易互補(bǔ)連接，稱為粘性末端；2.為平整切割，即兩條鏈在同一水平切開(kāi)，得到平齊末端。

5′…GAATTC…3′3′…CTTAAG…5′EcoRⅠ5′…GGCC…3′3′…CGCG…5′HaeIII第20頁(yè)/共61頁(yè)

每個(gè)人的DNA是不完全相同的，一般每100－500bp就有一個(gè)是不相同的，即多態(tài)性。堿基的變異就可能導(dǎo)致酶切點(diǎn)的消失或新的切點(diǎn)出現(xiàn)，當(dāng)使用同一限制酶切割不同個(gè)體基因組DNA時(shí)，DNA片段長(zhǎng)度出現(xiàn)差異，這種由于內(nèi)切酶切點(diǎn)變化所導(dǎo)致的DNA片段長(zhǎng)度的差異，稱為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）。

RFLP反映了常見(jiàn)的個(gè)體間DNA核苷酸的可遺傳性變異，它按照孟德?tīng)柗绞竭z傳。RFLP可用Southern印跡雜交法檢出。RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)第21頁(yè)/共61頁(yè)

等位基因2由于出現(xiàn)新的切點(diǎn)，DNA片段縮至8kb。

DNA片段電泳后雜交圖等位基因2探針位置12kb8kb8Kb4Kb等位基因1探針位置第22頁(yè)/共61頁(yè)分子雜交的基本過(guò)程待側(cè)核酸的制備待側(cè)核酸濾膜固定預(yù)雜交制備探針探針標(biāo)記加入標(biāo)記探針雜交去除剩余探針檢測(cè)雜交信號(hào)第23頁(yè)/共61頁(yè)1.SouthernBlot1.基因組DNA2.用限制酶消化3.凝膠電泳分離變性5.探針雜交6.放射自顯影4.濾膜轉(zhuǎn)印DNA

SouthernBlot是指將待測(cè)核酸分子結(jié)合到一定的固相支持物上的方法。第24頁(yè)/共61頁(yè)例1直接分析法鐮狀細(xì)胞貧血(HbS)：第5～7位密碼子AAASSSMstⅡ:CCTNAGG

1.2Kb

0.2Kb1.40Kb1.20Kb0.20KbA:CCTGAGGAGS:CCTGTGGAG第25頁(yè)/共61頁(yè)例2

Bgl酶對(duì)一血友病家系的RFLP分析II1

234567Ⅰ

12

5/55/-5/55/205/-5/2020/-5/-20/-5kb20kb第26頁(yè)/共61頁(yè)例3RFLP連鎖分析Neurofibroma,NF1RFLPⅠⅡⅢ1212345678123456784.7kb3.0kb第27頁(yè)/共61頁(yè)5.6Kb5.2Kb4.2Kb4.0KbHindⅢPKU，AR12ⅠⅡ123SphⅠ11.0Kb9.7Kb7.0Kb例4單體型分析第28頁(yè)/共61頁(yè)

當(dāng)基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時(shí)，可以合成等位基因特異的寡核苷酸探針（ASO）用于探測(cè)點(diǎn)突變時(shí)需要合成兩種或兩種以上的探針，一種與正?；蛐蛄型耆恢?，能與之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩(wěn)定雜交，但不能與正?；蛐蛄蟹€(wěn)定雜交，這樣，就可以把只有一個(gè)堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開(kāi)來(lái)。2.ASO（allele-specificoligonucleotide）第29頁(yè)/共61頁(yè)ASO斑點(diǎn)雜交1986年，胡流清等基于點(diǎn)突變?cè)?，用寡核苷酸探針進(jìn)行基因診斷。正常探針突變探針PKU，AR第30頁(yè)/共61頁(yè)P(yáng)CR是一項(xiàng)在模板、引物、耐熱DNA聚合酶、dNTP、適宜的溫度變化等條件下，按照變性、復(fù)性、引物延伸，循環(huán)往復(fù)20–40個(gè)周期，體外快速合成擴(kuò)增DNA的技術(shù)。高溫低溫退火中溫模板DNA引物與模板結(jié)合引物延伸周期1周期2變性二、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）相關(guān)技術(shù)第31頁(yè)/共61頁(yè)

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）

PCR原理第32頁(yè)/共61頁(yè)P(yáng)CR原理１變性第33頁(yè)/共61頁(yè)P(yáng)CR原理１復(fù)性第34頁(yè)/共61頁(yè)P(yáng)CR原理１延伸第35頁(yè)/共61頁(yè)P(yáng)CR原理２變性第36頁(yè)/共61頁(yè)P(yáng)CR原理２復(fù)性第37頁(yè)/共61頁(yè)P(yáng)CR原理２延伸第38頁(yè)/共61頁(yè)P(yáng)CR原理３變性第39頁(yè)/共61頁(yè)P(yáng)CR原理３復(fù)性第40頁(yè)/共61頁(yè)P(yáng)CR原理３延伸第41頁(yè)/共61頁(yè)

DNA以指數(shù)形式擴(kuò)增(2n)，其中長(zhǎng)片段以線性形式擴(kuò)增(2n+2)，最終主產(chǎn)物片段長(zhǎng)度在兩個(gè)引物之間。長(zhǎng)片段（單鏈）24016256７11452228200短片段（單鏈）1412108642128643216８４２總片段（單鏈）６５４３２１０循環(huán)數(shù)第42頁(yè)/共61頁(yè)預(yù)變性(92-95C,2-5m)變性(92-95C,30s)復(fù)性(40-60C,30s)延伸

(72C,30-60s)總延伸

(72C,7m)(25-35)PCR的一般過(guò)程：經(jīng)過(guò)30次的循環(huán),擴(kuò)增的DNA片段可達(dá)100萬(wàn)倍以上。第43頁(yè)/共61頁(yè)

1.2kb0.2kb鐮狀細(xì)胞貧血(HbS)：第5～7位密碼子MstⅡ:CCTNAGGA:CCTGAGGAGS:CCTGTGGAGPCR-RFLP第44頁(yè)/共61頁(yè)P(yáng)CR-RFLP第45頁(yè)/共61頁(yè)SSCP技術(shù)對(duì)照DNA被檢DNA

單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對(duì)等分子內(nèi)相互作用力來(lái)維持的，當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，會(huì)或多或少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變。第46頁(yè)/共61頁(yè)P(yáng)CR-SSCP1989年，Orita等建立的PCR產(chǎn)物單鏈DNA凝膠電泳技術(shù)。12345ab1：正常人2,4,5：純合體患者3：雜合體(2的弟弟)左為泳動(dòng)變位模式：a正常人；b純合體患者第47頁(yè)/共61頁(yè)GAA→GAGTGT→TATCTC→CACPCR-SSCP第48頁(yè)/共61頁(yè)在人類基因組中還存在一類DNA重復(fù)序列，稱為小衛(wèi)星DNA。它們分布十分廣泛，每個(gè)重復(fù)單位通常只有幾－－幾十個(gè)堿基對(duì)，但其重復(fù)次數(shù)在人群中是高度變異的，又叫數(shù)目變異的串聯(lián)重復(fù)（variablenumbertandemrepeats,VNTR）。當(dāng)用限制酶切割VNTR區(qū)時(shí)，只要酶切點(diǎn)不在重復(fù)區(qū)內(nèi)，就可能得到各種長(zhǎng)度不同的片段，可用于致病基因的連鎖分析。探針酶切后電泳VNTR第49頁(yè)/共61頁(yè)IV12I12

III1234567891011II123456454144424630例如：延遲顯性遺傳病的診斷正常人IT15基因(CAG)n≤26表型正常前突變個(gè)體27≤(CAG)n≤35不完全外顯個(gè)體26≤(CAG)n≤39完全外顯患者(CAG)n≥40Segment2

癥狀前診斷第50頁(yè)/共61頁(yè)出生前診斷Segment3

對(duì)胚胎或胎兒在出生前是否患有某種遺傳病或先天畸形做出的診斷稱為產(chǎn)前診斷，又叫宮內(nèi)診斷。第51頁(yè)/共61頁(yè)產(chǎn)前診斷的對(duì)象年齡在三十五歲以上的高齡孕婦；曾生育過(guò)染色體異常的患兒的夫婦；夫婦一方有染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常者；有先天性代謝缺陷或生育過(guò)此類患兒的夫婦；夫婦一方為嚴(yán)重性連鎖隱性遺傳病攜帶者；生育過(guò)多發(fā)畸形患兒的夫婦；有原因不明的多發(fā)流產(chǎn)、死產(chǎn)或死胎的夫婦；有明顯致畸因素接觸史的夫婦；？第52頁(yè)/共61頁(yè)一、創(chuàng)傷性方法：包括羊膜穿刺、絨毛取樣、臍周血取