酶聯(lián)免疫吸附試驗——ELISA第1頁/共38頁（一）ELISA的原理ELISA的基本原理三種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑”（immunosorbent）②酶標記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）③酶作用的底物第2頁/共38頁在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。第3頁/共38頁加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。

第4頁/共38頁（二）方法類型及反應原理雙抗體夾心法間接法競爭法捕獲法第5頁/共38頁1雙抗體夾心法

——是檢測抗原最常用的方法第6頁/共38頁第7頁/共38頁操作步驟1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。2）加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復合物，洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。3）加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標抗體，此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關(guān)。4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。第8頁/共38頁應用此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。

第9頁/共38頁2間接法

——是檢測抗體常用的方法

第10頁/共38頁第11頁/共38頁基本步驟1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。2）加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。3）加酶標抗抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結(jié)合，從而間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關(guān)。4）加底物顯色。第12頁/共38頁應用檢測Ab的最常用的方法只要更換不同的固相Ag，可以用一種酶標二抗檢測各種與Ag相應的Ab。第13頁/共38頁3競爭法第14頁/共38頁其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺于陰性反應。方法相同第15頁/共38頁ELISA的基本步驟包被—洗滌—封閉—洗滌—加樣—加酶結(jié)合物—加底物、顯色劑—終止液—酶標儀檢測第16頁/共38頁包被將抗原或抗體固定化的過程稱為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。第17頁/共38頁固相載體固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學反應?？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。

ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，國際上標準的微量滴定板為8×12的96孔式。第18頁/共38頁固相載體

微顆粒帶有蛋白質(zhì)結(jié)合功能基團，結(jié)合容量大、反應速度快膜載體硝酸纖維素膜（NC）、玻璃纖維素膜、尼龍膜，非共價鍵結(jié)合，但吸附能力強斑點ELISA第19頁/共38頁洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。

第20頁/共38頁封閉●

包被好的固相載體表面常留有少量未吸附位點，可非特異地吸附測定時加入的標本和酶標記物中的蛋白質(zhì)，導致本底偏高。因此需用1％～5％牛血清白蛋白或5％～20％小牛血清等包被一次，消除上述干擾，此過程稱為封閉。

●

一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。

第21頁/共38頁加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。

加標本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。第22頁/共38頁加酶結(jié)合物結(jié)合物即酶標記的抗體（或抗原），是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。

ELISA的酶應符合以下要求：純度高，催化反應的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。最好在受檢標本中不存在相同的酶。另外，它的相應底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。

第23頁/共38頁常用的酶和底物1、辣根過氧化物酶（horsradishperoxidase,HRP）糖蛋白主酶+亞鐵血紅素輔基（活性基團）純度：RZ=OD403/OD275,>3.1酶活性：U：1min將1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。反應式：DH2+H2O2D+2H2O底物：OPD,TMB,5-ASA,ABTS第24頁/共38頁酶作用后顯色終止液終止反應顯色最大吸收峰致癌避光OPD橙黃色H2SO4棕黃色492nm有需要TMB藍色H2SO4黃色450nm無無需OPD和TMB的比較第25頁/共38頁底物顯色終止液最大吸收峰特點APp-NPP黃色NaOH405nmβ-Gal4MUG熒光物4MU//均相酶免疫測定2、堿性磷酸酶和β半乳糖苷酶的比較第26頁/共38頁顯色顯色是ELISA中的最后一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。在定量測定中，加入底物后的反應溫度和時間應按規(guī)定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行，時間一般不需要嚴格控制，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當縮短或延長反應時間，及時判斷。

第27頁/共38頁酶反應終止液常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。

第28頁/共38頁比色比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。酶標比色儀檢測酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指專用于測讀ELISA結(jié)果吸光度的光度計。第29頁/共38頁結(jié)果判斷定性測定對受檢標本中是否含有待測抗原或抗體作出“有”或“無”的簡單回答，分別用“陽性”、“陰性”表示定量測定

在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條件下制作標準曲線，根據(jù)標準曲線得到樣品中待測抗原的量。第30頁/共38頁預期結(jié)果陽性：顯色為黃色陰性：無色1234陰性陰性陽性陽性第31頁/共38頁試劑盒的組成

完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：

（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）

（2）酶標記的抗原或抗體（結(jié)合物）

（3）酶的底物；

（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中）參考標準品和控制血清（定量測定中）；

（5）結(jié)合物及標本的稀釋液；

（6）洗滌液；（7）顯色液

（8）酶反應終止液。第32頁/共38頁本次實驗內(nèi)容乙肝表面抗原的檢測具體操作見說明書(一組7孔)第33頁/共38頁乙肝相關(guān)知識慢性乙型肝炎是一種由乙型肝炎病毒（HBV）引起的慢性、傳染性疾病，嚴重危害健康，影響生活質(zhì)量。1.乙肝的流行病學全世界半數(shù)以上的人被感染過，5％為慢性感染，每年有5000萬新感染，100萬死亡。我國有9.8％HBsAg（＋），慢性達1000萬，60％人群感染。第34頁/共38頁2.傳播途徑傳染源：HBV攜帶者、乙肝患者血液、體液（精液、陰道分泌物、唾液）傳播途徑：血液、血制品、性、垂直、日常密切接觸易感人群：母親是HBV感染的嬰兒、HBV感染家庭成員、吸毒者、性病病人、血透病人、部分醫(yī)護人員第35頁/共38頁4.乙肝病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因組的特點HBV顆粒：小球形顆粒（無病毒核酸，無感染性）——病毒顆粒包膜產(chǎn)生過剩管形顆粒（小球顆粒連接而成）

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