核酸-分子生物學(xué)2016年4月18日1NUCLEOTIDES（核苷酸）Base:

Adenine,Guanine,Thymine(Uracil),CytosineSugar:

ribose,deoxy-ribosePhosphates:

1-3viaphosphateesterbondsnucleotide2核苷nucleoside=base+sugar31’

2’

4’

3’

5’

Sugar：核糖和脫氧核糖-呋喃糖4Bases堿基嘌呤嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶鳥嘌啉腺嘌啉尿嘧啶5Nucleotide6名稱與縮寫(1)RNA：ribonucleicacid核糖核酸DNA：deoxyribonucleicacid脫氧核糖核酸pyrimidine嘧啶：cytosine (Cyt，C) 胞嘧啶Thymine (Thy，T) 胸腺嘧啶Uracil (Ura，U) 尿嘧啶purine嘌啉：Adenine (Ade，A) 腺嘌啉Guanine (Gua，G) 鳥嘌啉7名稱與縮寫(2)Ribonucleoside 核糖核苷（不帶磷酸）Adenosine (Ado) 腺(嘌啉核)苷Guanosine (Guo) 鳥(嘌啉核)苷cytidine (Cyd) 胞(嘧啶核)苷Thymidine (Thd) 胸(腺嘧啶脫氧核)苷Uridine (Urd) 尿(嘧啶核)苷Ribonucleotide 核糖核苷酸（帶磷酸）

adenosine5’-mono(di,tri)phosphaste; AMP,ADP,ATPdeoxyribonucleoside脫氧核糖核苷

deoxyadenosine(dAdo)……deoxyribonucleotide脫氧核糖核苷酸

dAMP,dADP,dATP……dNTP8磷酸二酯鍵

連接

核苷酸5’

3’9DNA是遺傳物質(zhì)的載體10核酸化學(xué)研究史（5）1928年，Griffith的細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)；1944年Averyetal.等的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DNA是遺傳物質(zhì)；1952年Hershey-Chase實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)DNA是遺傳物質(zhì)。11123412Avery等所作的工作是：不斷地去除(乙醇和相應(yīng)的水解酶處理)S型細(xì)菌中各種成分(蛋白質(zhì)、莢膜多糖、RNA等)，然后得到純化的“轉(zhuǎn)化因子”；接著對(duì)純化的“轉(zhuǎn)化因子”進(jìn)行鑒定，確認(rèn)它就是DNA13Killingthebacteriawithheat；Extractingthesaline-solublecomponents；Theproteinwasprecipitatedoutusingchloroformandthepolysaccharidecapsuleswerehydrolyzedwithanenzyme;Then,theactiveportionwasprecipitatedoutbyalcoholfractionation,resultinginfibrousstrandsthatcouldberemovedwithastirringrod.提純步驟質(zhì)疑：ThereareproteincontaminantsintheDNAextractionwhichcouldbethematerialofinheritance.實(shí)驗(yàn)證明:TreatmentoftheDNAwithproteolyticenzymes[trypsin,chymotrypsinandribonuclease(enzymesthatbreakapartproteinsorRNA)]didnotdestroythetranformationactivity,buttreatmentwithdeoxyribonucleases["deoxyribonucleodepolymerase"(acrudepreparation,obtainablefromanumberofanimalsources,thatcouldbreakdownDNA)]did.14151952年Hershey-Chase實(shí)驗(yàn)1617DNA的結(jié)構(gòu)與特性18AStructureforDeoxyriboseNucleicAcid

WatsonJ.D.andCrickF.H.C.

Nature

171,737-738(1953)

April25,1953:JamesWatsonandFrancisCrick‘sclassicpaperthatfirstdescribesthedoublehelicalstructureofDNA.Withsomeunderstatementtheynotethatthestructure“suggestsapossiblecopyingmechanismforthegeneticmaterial”.1953年Watson-Crick的DNA雙螺旋19Watson-Crick的DNA雙螺旋2.0nm20RNA結(jié)構(gòu)與特性21RNA分子在糖基上比DNA分子多一個(gè)OH基，位于2’位。A260nm/A280nm=2.0,

而DNA為1.8。RNA分子遇堿極易降解，而DNA則不。RNA分子一般為單鏈分子，因此容易形成自由能為最小的獨(dú)特的二級(jí)結(jié)構(gòu),其雙鏈部分符合Watson-Click雙螺旋模型。正因?yàn)楠?dú)特的二級(jí)結(jié)構(gòu)和多余的2’羥基的存在，一些RNA分子具有自我切斷、自我連接，或切斷其他核酸分子、連接其他核酸分子的活性，第一個(gè)可以自我復(fù)制的分子被認(rèn)為是RNA分子。RNA分子22RNA分子可以通過由蛋白質(zhì)酶催化的反應(yīng)轉(zhuǎn)化為DNA分子(Ribonucleosidediphosphatereductase)。RNA分子在細(xì)胞中同時(shí)扮演著信息的媒介作用和執(zhí)行者的作用，mRNA為前者，rRNA、tRNA和snRNA為后者。因此很自然的認(rèn)為生命的早期可以稱為RNAworld。RNA分子比DNA分子更容易受到修飾，均有其用途(作用)，如mRNA的5’帽子能啟動(dòng)蛋白質(zhì)的翻譯，tRNA上的修飾可以增加tRNA的壽命。真核細(xì)胞的基因擁有令人吃驚的特點(diǎn)，順序中插入了很多不編碼氨基酸的序列（Interveningsequence,或叫內(nèi)含子(intron)），這些序列得到轉(zhuǎn)錄后在mRNA成熟之前被除去。23RNA的功能1.遺傳密碼的中間擔(dān)體(mRNA)2.mRNA剪接等加工的活性成份(snRNA)3.核糖體的骨架結(jié)構(gòu)及與mRNA的識(shí)別(rRNA)4.活化氨基酸的擔(dān)體(tRNA)5.基因表達(dá)的調(diào)節(jié)（miRNA）6.酶的活性成份7.病毒基因組的載體……

24三種RNA分子MessengerRNA(mRNA)isthetemplateforproteinsynthesisortranslation.Consequently,mRNAisaheterogeneousclassofmolecules.InE.coli,theaveragelengthofanmRNAmoleculeisabout1.2kilobases(kb).TransferRNA(tRNA)carriesaminoacidsinanactivatedformtotheribosomeforpeptide-bondformation,inasequencedictatedbythemRNAtemplate.ThereisatleastonekindoftRNAforeachofthe20aminoacids.TransferRNAconsistsofabout75nucleotides(havingamassofabout25kd).RibosomalRNA(rRNA),themajorcomponentofribosomes,playsbothacatalyticandastructuralroleinproteinsynthesis.InE.coli,therearethreekindsofrRNA,called23S,16S,and5SRNAbecauseoftheirsedimentationbehavior.OnemoleculeofeachofthesespeciesofrRNAispresentineachribosome.25雙螺旋的基礎(chǔ)

—堿基配對(duì)26DNA中的四種堿基及它們間的氫鍵胞嘧啶胸腺嘧啶鳥嘌啉腺嘌啉TCAG27雙螺旋分子中糖分子與縱軸平行，與堿基平面垂直穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的作用力為氫鍵和堿基堆積力（即疏水作用）28Watson-Crick的DNA雙螺旋的特征Twohelicalpolynucleotidechainsarecoiledaroundacommonaxis.Thechainsruninoppositedirections.Thesugar-phosphatebackbonesareontheoutsideand,therefore,thepurineandpyrimidinebaseslieontheinsideofthehelix.Thebasesarenearlyperpendiculartothehelixaxis,andadjacentbasesareseparatedby3.4?.Thehelicalstructurerepeatsevery34?,sothereare10bases(=34?perrepeat/3.4?perbase)perturnofhelix.Thereisarotationof36degreesperbase(360degreesperfullturn/10basesperturn).Thediameterofthehelixis20?.29Watson-Crick的DNA雙螺旋30A-DNAB-DNAZ-DNA3132DNA的半保留復(fù)制33堿基的配對(duì)使得雙螺旋DNA分子在復(fù)制時(shí)以半保留的形式進(jìn)行34Messelson和Stahl的實(shí)驗(yàn)E.colicells

氮是DNA的重要組成部分，氮14（14N）則是氮中最常見的同位素，而較重的氮15（15N）在自然界也可以獨(dú)立存在，并不具有放射性，只是相對(duì)比重較大。實(shí)驗(yàn)首先將大腸桿菌培養(yǎng)在含有氮15的培養(yǎng)基之中數(shù)個(gè)世代，等這些細(xì)菌的DNA只含有氮15之后，再放入含有氮14的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)1代后，抽取樣本提取DNA，再采用氯化銫密度梯度離心法分析。35(A)UltravioletabsorptionphotographofacentrifugecellshowingthetwodistinctbandsofDNA.(B)Densitometrictracingoftheabsorptionphotograph.[FromM.MeselsonandF.W.Stahl.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.44(1958):671.]Thedistributionof14Nand15Nwasrevealedbythetechniqueofdensity-gradientequilibriumsedimentation（密度梯度離心法）.36DNAwasextractedfromthebacteriaatvarioustimesaftertheyweretransferredfroma15Ntoa14Nmediumandcentrifuged.37DNA的變性與復(fù)性38DNA分子的變性39DNA的變性在紫外吸收上的變化1.37倍Hyperchromiceffect增色效應(yīng)1OD260dsDNA 50gssDNA 37gRNA 40g不同來源DNA的變性曲線40增色效應(yīng)：指DNA變性后其紫外吸收明顯增加的效應(yīng)。DNA分子中堿基間電子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波長紫外光的特性。在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基藏入螺旋內(nèi)側(cè)，變性時(shí)DNA雙螺旋解開，于是堿基外露，堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收，故而產(chǎn)生增色效應(yīng)。41DNA分子的Tm與GC含量有關(guān)42鹽濃度對(duì)DNA變性的影響43DNA的復(fù)性：

指經(jīng)加熱變性的DNA在適當(dāng)條件下，二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性(renaturation)，此過程也稱為退火(annealing)。44DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析45DNA的序列測(cè)定（2）－－ddNTP法Sanger法FrederickSanger

(13August1918

–19November2013)46NTP,dNTPsandddNTPs47測(cè)序反應(yīng)四管反應(yīng)：模板+引物+DNA聚合酶+4種dNTPs+1種特異的ddNTP4849每一種雙脫氧核苷酸上可以連接上一個(gè)熒光標(biāo)記分子，使得每一段被終止位置的寡核苷酸片段產(chǎn)生不同的熒光。所有標(biāo)記的雙脫氧核苷酸被加入同一根反應(yīng)管，結(jié)果帶不同熒光顏色的DNA片段用毛細(xì)管電泳按片段大小被分離，每個(gè)片段通過激光束給出一個(gè)單一峰，DNA序列通過峰的顏色被閱讀。DNA序列分析儀：四色熒光基團(tuán)標(biāo)記的ddNTP50PCR

PolymeraseChainReaction

聚合酶鏈反應(yīng)51AmplificationofDNAbyPCR高效：N次循環(huán)后，得到2N的DNA產(chǎn)物52PCR的流程Strandseparation.

ThetwostrandsoftheparentDNAmoleculeareseparatedbyheatingthesolutionto95°Cfor15s.Hybridizationofprimers.

Thesolutionisthenabruptlycooledto54°CtoalloweachprimertohybridizetoaDNAstrand.ParentDNAduplexesdonotform,becausetheprimersarepresentinlargeexcess.Primersaretypicallyfrom20to30nucleotideslong.DNAsynthesis.

Thesolutionisthenheatedto72°C,theoptimaltemperatureforTaqDNApolymerase.DNAsynthesistakesplaceonbothstrandsbutextendsbeyondthetargetsequence.53CalculationofthemeltingtemperatureorTmoftheprimer-templatehybrid:Tm=(4x[G+C])+(2x[A+T])oCTheannealingtemperatureforPCRis2-5oCbelowTm.Note:twoprimersshouldbedesignedtohavesameTm54發(fā)夾結(jié)構(gòu)55十字形結(jié)構(gòu)56DNAmutations57DNAmutations自發(fā)反應(yīng)脫氨基etc.外界誘導(dǎo)化學(xué)因素：亞硝酸鹽等UVlight氧化損傷衰老癌癥…58胞嘧啶脫氨基

CytosineDeamination胞嘧啶脫氨基變成尿嘧啶，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中平均每天發(fā)生100次，而腺嘌呤和鳥嘌呤的脫氨基要慢100倍。尿嘧啶在DNA中會(huì)被修復(fù)系統(tǒng)更正，未修復(fù)的U在復(fù)制時(shí)與A配對(duì)，而不是G，導(dǎo)致變異。59Uracilreadilyundergoesregularreactionsincludingoxidation,nitration,andalkylation.Uracilundergoes

amide-imidicacidtautomericshifts（酰胺-亞胺酸互變異構(gòu)）.內(nèi)酰胺內(nèi)酰亞胺尿嘧啶的不穩(wěn)定性60原核DNA

vs.

真核DNA61DNA的分子形狀原核生物的基因組DNA（即染色體）、質(zhì)粒（plasmid）DNA，和一些病毒DNA，呈環(huán)狀。真核生物的染色體DNA，大部分噬菌體DNA，和一些病毒DNA，呈線狀。62真核生物的DNA不裸露平均每200bp的DNA繞核小體左旋1.75轉(zhuǎn)，因此真核生物的DNA分子為正超螺旋63細(xì)菌質(zhì)粒DNA的不同狀態(tài)松弛型超螺旋部分解鏈64超螺旋DNA(SupercoiledDNA)RelaxedmoleculeSupercoiledmolecule65正螺旋和負(fù)螺旋DNA雙螺旋為右旋螺旋。細(xì)胞中的環(huán)狀DNA一般呈負(fù)超螺旋，即右旋螺旋不足導(dǎo)致部分堿基不形成配對(duì)，分子通過整體拓?fù)鋵W(xué)上的右旋來補(bǔ)足右旋螺旋的不足，在數(shù)學(xué)上呈1：1，即分子整體右旋一圈來補(bǔ)雙螺旋上的一圈不足。正超螺旋

左旋負(fù)超螺旋

右旋66正超螺旋為雙螺旋旋轉(zhuǎn)過度，通過分子整體的左旋來解去過度的螺旋。不同形狀的DNA分子在瓊脂糖中的遷移率松弛型，OC,OpencircularDNA超螺旋,CCC,covalently-closedcircularDNA從細(xì)菌抽提得到的質(zhì)粒DNA樣品中不含線狀DNA67從大腸桿菌用常規(guī)方法得到的質(zhì)粒DNA經(jīng)常是這個(gè)樣子?電泳方向線性化前線性化后68DNAReplication69半保留復(fù)制70SemiconservativereplicationofDNADNA的復(fù)制遵循半保留原則進(jìn)行.親代DNA分子每一條鏈各自作為模板，合成一條互補(bǔ)鏈，新合成的兩條鏈中一條是舊鏈，一條為新鏈1958年MatthewMesselson和FranklinStahl用令人信服的實(shí)驗(yàn)證明了DNA的半保留復(fù)制機(jī)制半保留復(fù)制機(jī)制71DNA的復(fù)制過程起始階段：DNA解旋酶在局部展開雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA分子為單鏈，引物酶辨認(rèn)起始位點(diǎn)，以解開的一段DNA為模板，按照5'到3'方向合成RNA短鏈，形成RNA引物。DNA片段的生成：在引物提供了3'-OH末端的基礎(chǔ)上，DNA聚合酶催化DNA的兩條鏈同時(shí)進(jìn)行復(fù)制過程，由于復(fù)制過程只能由5'->3'方向合成，因此一條鏈能夠連續(xù)合成，另一條鏈分段合成，其中每一段短鏈成為岡崎片段（Okazakifragments）。RNA引物的水解：當(dāng)DNA合成一定長度后，DNA聚合酶水解RNA引物，補(bǔ)填缺口。DNA連接酶將DNA片段連接起來，形成完整的DNA分子。72大腸桿菌和其他細(xì)菌DNA的復(fù)制有一個(gè)固定的起點(diǎn)，稱為replicationorigin(ori),復(fù)制從ori的兩個(gè)方向同時(shí)進(jìn)行，形成兩個(gè)復(fù)制叉(replicationfork)。oriC是大腸桿菌的復(fù)制起始點(diǎn)，由245個(gè)堿基組成。DNA復(fù)制的起點(diǎn)和方向

(Replicationorigin&direction)73DNA復(fù)制的幾種模式雙向復(fù)制(Bidirectional)形(大腸桿菌等細(xì)菌DNA);線性染色體(真核細(xì)胞);單向復(fù)制(Unidirectional)D型(病毒DNA);滾環(huán)式(噬菌體DNA)74StructureoforiCEcoli基因組只有一個(gè)oriC,但人基因組有上萬個(gè)復(fù)制ori75DNAreplicationofE.coli電鏡照片新生鏈（紅色）76DNA復(fù)制過程中形成的鏈狀分子(Catenatedchromosomes)需要拓?fù)涿竵韼椭怆x77DnaA等蛋白質(zhì)結(jié)合到大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)oriC的特征核苷酸序列上；解旋酶(Helicase)幫助將雙鏈DNA解旋成單鏈DNA；SSB(單鏈DNA結(jié)合蛋白)與單鏈DNA結(jié)合幫助穩(wěn)定單鏈結(jié)構(gòu)；Primase（引物酶）合成RNA片段；DNA聚合酶III以RNA片段為引物開始合成DNADNA復(fù)制過程78DNA復(fù)制從5’到3’發(fā)生79Okazaki片段

(Okazakifragment)雙鏈DNA的兩條鏈走向相反，而DNA的合成酶只能5’3’的方向合成，這顯然有矛盾。岡崎(ReijiOkazaki)利用同位素標(biāo)記新生DNA分子后發(fā)現(xiàn)，半數(shù)同位素先參入到較短的DNA片段中。80ThreemodelsforDNAreplicationforkOkazaki證明為這種81WhatOkazakidid？Pulse-labeling實(shí)驗(yàn)：大腸桿菌在含同位素培養(yǎng)基中培養(yǎng)5秒（紅）后分離大腸桿菌DNA，在堿性條件下超離心；Pulse-chase實(shí)驗(yàn):將大腸桿菌在含同位素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5秒鐘（紅）后切換到正常培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，一段時(shí)間后分離DNA，在堿性條件下進(jìn)行超離心。82復(fù)制叉(Replicationfork)前導(dǎo)鏈后隨鏈83復(fù)制叉846.DNA復(fù)制叉(replicationfork)的形成，DNA合成向兩個(gè)方向同時(shí)進(jìn)行,滯后鏈(laggingstrand)上的Okazaki片段不斷被連接成大片段；7.拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topoisomerases)幫助消除復(fù)制過程中DNA螺旋產(chǎn)生的糾纏；8.RNA引物被DNA聚合酶I去除,補(bǔ)齊缺口;9.最終由連接酶連接成完整的染色體DNA.DNA復(fù)制過程（續(xù)）8586DNA復(fù)制相關(guān)的幾種酶DNA聚合酶(polymerase)連接酶(ligase)拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)其他蛋白質(zhì)87大腸桿菌中的五種DNA聚合酶PolI:implicatedinDNArepair;has5'->3'(Polymerase)activityandboth3'->5'exonuclease(Proofreading)and5'->3'exonucleaseactivity(RNAPrimerremoval).PolII:involvedinreparationofdamagedDNA;has3'->5'exonucleaseactivity.PolIII:themainpolymeraseinbacteria(elongatesinDNAreplication);has3'->5'exonucleaseproofreadingability.PolIV:aY-familyDNApolymerase.PolV:aY-familyDNApolymerase;participatesinbypassingDNAdamage.88大腸桿菌中的DNA聚合酶I，II，III89DNA聚合酶III由多亞基組成90RingstructuremodelforthelaggingstrandofDNAreplication9192亞基形成一個(gè)圍繞DNA的環(huán)狀鉗93大腸桿菌中的DNA聚合酶I，II，III94DNAPolymeraseI“Activities”5’-3’Polymerase:(normal)3’-5’exonuclease:removeslastbaseingrowingstrandifincorrect

5’-3’exonuclease:removesRNAprimer(while5’-3’Polymerasefillsingap)95DNA聚合酶I的切口平移反應(yīng)（Nicktranslation)Key:5’→3’聚合酶活性+5’→3’外切酶活性96DNA聚合酶I由一條肽鏈組成，含三種酶活性，蛋白水解酶subtilisin酶解后得到的大片段部分為Klenowfragment，擁有兩個(gè)酶活性，去掉了5’→3’外切酶活性。97RNA引物由DNA聚合酶I的5’3’外切酶

活性除去RNAprimer98FunctionofDNAligase99Mechanismforligationreaction100復(fù)制終止細(xì)菌的環(huán)狀DNA復(fù)制結(jié)束時(shí)，兩個(gè)復(fù)制叉相遇，細(xì)菌利用終止序列調(diào)控使得只有一個(gè)復(fù)制叉通過。真核細(xì)胞在染色體的不同位置同時(shí)起始DNA復(fù)制，也可以在不同的位置結(jié)束復(fù)制，具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。由于真核DNA是線性的，DNA復(fù)制時(shí)的染色體的末端（端粒）會(huì)丟失一些堿基。101端粒端粒是染色體末端的DNA重復(fù)序列，作用是保持染色體的完整性。細(xì)胞有絲分裂一次，發(fā)生DNA的復(fù)制。DNA每次復(fù)制端粒就縮短一點(diǎn)。一旦端粒消耗殆盡，染色體則易于突變而導(dǎo)致動(dòng)脈硬化和某些癌癥。因此，端粒和細(xì)胞老化有明顯的關(guān)系。102103Crick’scentraldogmaRNA

Transcription

ProteinTranslationDNADNA

ReplicationGeneExpression104細(xì)胞中與蛋白翻譯

相關(guān)的RNA：

mRNA

snRNA

tRNA

rRNA105DNAtranscription

&mRNA106模板鏈與非模板鏈兩條鏈可以同時(shí)成為模板鏈，但編碼不同的蛋白質(zhì)107原核生物的基因結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始結(jié)構(gòu)基因1結(jié)構(gòu)基因2結(jié)構(gòu)基因3轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止DNA108真核生物的基因結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄終止子109真核基因mRNA的形成110真核基因成熟mRNA的結(jié)構(gòu)5’cap【5'端帽】5’UTR(Untranslatedregion)【5'非轉(zhuǎn)譯區(qū)】CDS(Codingsequence)【編碼區(qū)】3’UTR【3'非轉(zhuǎn)譯區(qū)】Poly-Atail【poly(A)尾鏈】111在轉(zhuǎn)錄的過程中，第二型RNA聚合酶（RNApolymeraseII）從DNA中復(fù)制出一段遺傳訊息到mRNA前體上，這個(gè)前體成為pre-mRNA（尚未經(jīng)過修飾或是部份經(jīng)過修飾的mRNA，稱作pre-messengerRNA，pre-mRNA）。pre-mRNA需要加上一個(gè)5'端帽（capping）--經(jīng)過甲基化（methylation）修飾的鳥嘌呤。這個(gè)5'端帽對(duì)于mRNA運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)并與之后接到適當(dāng)?shù)暮颂求w，以及mRNA本身的穩(wěn)定是相當(dāng)重要的。mRNA如果缺乏5'端帽，則很容易就被降解掉。而mRNA由5'到3'的降解亦是由移除5'端帽開始。真核生物mRNA的5'端帽112真核生物mRNA的5'端帽113mRNA剪接(mRNAsplicing)mRNA剪接—mRNA前體去除掉內(nèi)含子而保留外顯子的修飾過程。通常mRNA前體能經(jīng)由數(shù)種不同的剪接方式，產(chǎn)生不同組態(tài)／型式的mRNA，使一段基因在不同的組織或發(fā)育過程中能經(jīng)過轉(zhuǎn)錄-剪接-轉(zhuǎn)譯后產(chǎn)生不同型式的蛋白質(zhì)，進(jìn)而擁有不同的作用，或是產(chǎn)生出穩(wěn)定性差的mRNA達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的。這種剪接型態(tài)叫做選擇性剪接(Alternativesplicing)。114mRNA剪接(mRNAsplicing)最常見的內(nèi)含子是所謂的GT-AG-內(nèi)含子。它以GU開頭并以AG結(jié)尾。115選擇性剪接(Alternativesplicing)116雞卵清蛋白mRNA與它的基因雜交，intron存在的直觀證據(jù)117RichardJ.Roberts&PhillipAllenSharpsharedthe1993NobelPrizeinPhysiologyorMedicinewithfor"thediscoverythatgenesineukaryotesarenotcontiguousstringsbutcontainintrons,andthatthesplicingofmessengerRNAtodeletethoseintronscanoccurindifferentways,yieldingdifferentproteinsfromthesameDNAsequence".1993年Nobel生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)1181993年Nobel生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)RichardJ.RobertsPhillipA.Sharp119真核生物mRNA的3’poly(A)尾鏈多聚腺苷酸化（polyadenylation）--由多聚腺苷酸聚合酶，在mRNA前體的3'端上加上了一段數(shù)個(gè)腺嘌呤序列（通常是數(shù)百個(gè)）。這段多聚腺苷酸尾鏈在轉(zhuǎn)錄的時(shí)候，會(huì)因?yàn)閙RNA上一段特殊的訊息，AAUAAA，而在mRNA后方特定位置上加上多聚腺苷酸尾鏈。多聚腺苷酸尾鏈會(huì)被多聚腺苷酸結(jié)合蛋白（poly(A)+tail-bindingprotein,PABP）辨識(shí)并保護(hù)住。120mRNA降解AU-richelementdecayNonsensemediateddecaySmallinterferingRNA(siRNA)MicroRNA(miRNA)Otherdecaymechanisms121RNA干擾(RNAi),原始的防御體系122123124mRNATranslation

&tRNA125Translation:翻譯翻譯是根據(jù)遺傳密碼的中心法則，將成熟的信使RNA分子中核苷酸序列解碼，并生成對(duì)應(yīng)的特定氨基酸序列的過程，是蛋白質(zhì)生物合成過程中的第一步。翻譯的過程大致可分作三個(gè)階段：起始、延長、終止。翻譯主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的核糖體中進(jìn)行，氨基酸分子通過轉(zhuǎn)運(yùn)RNA被帶到核糖體上。126核糖體，蛋白質(zhì)和核酸的復(fù)合體127核糖體由兩個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基由數(shù)十個(gè)蛋白質(zhì)和3－4種rRNA組成16SrRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)12830S亞基的三維結(jié)構(gòu)129翻譯的過程130起始翻譯開始時(shí)核糖體的一個(gè)小單位與mRNA的“開始”密碼子結(jié)合，這個(gè)“開始”密碼子標(biāo)志著mRNA上蛋白質(zhì)的信息的開始位置。一般“開始”密碼子的順序是AUG，不過在原核生物中有不少其它的碼。延長一個(gè)激活的tRNA進(jìn)入核糖體的A位與mRNA相配，肽酰轉(zhuǎn)移酶在鄰近的氨基酸間建立一個(gè)肽鍵，此后在P位上的氨基酸離開它的tRNA與A位上的tRNA結(jié)合，核糖體則相對(duì)于mRNA向前滑動(dòng)，原來在A位上的tRNA移動(dòng)到P位上，原來在P位上的空的tRNA移動(dòng)到E位上，然后在下一個(gè)tRNA進(jìn)入A位之前被釋放。結(jié)束以上的過程不斷重復(fù)直到核糖體遇到三個(gè)結(jié)束密碼子之一，翻譯過程終止。131核糖體上蛋白質(zhì)合成過程中mRNA、tRNA的作用及肽鏈延伸示意圖mRNAtRNA核糖體132133一條mRNA上可以有多個(gè)核糖體同時(shí)合成蛋白質(zhì)原核生物基因轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)的合成可以同步進(jìn)行134tRNA與氨基酸的連接135Crick繪制的密碼圖136Crick的中心法則DNA1957年轉(zhuǎn)錄RNA翻譯ProteinDNA1970年反轉(zhuǎn)錄ProteinRNA137反轉(zhuǎn)錄病毒最早在1911年由PeytonRous從鄰居小孩抱來的一只得腫瘤的雞上分離到，命名為RSV(Roussarcomavirus)。138Rous在1966年獲得Nobel生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1962年Tamin預(yù)測(cè)該病毒中存在RNA反轉(zhuǎn)錄酶，但要到1970年才檢測(cè)到。1975年Nobel生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)

"fortheirdiscoveriesconcerningtheinteractionbetweentumourvirusesandthegeneticmaterialofthecell"DavidBaltimore(1938-)RenatoDulbecco(1914-)HowardMartinTemin(1934-1994)139逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶140分子生物學(xué)技術(shù)DNAGelelectrophoresis.Hybridization-Blottingtechniques.

Restriction-enzymeanalysis.DNAsequencing.Solid-phasesynthesisofnucleicacids.Thepolymerasechainreaction(PCR).141核酸的分離純化及測(cè)定142遺傳信息全部貯存在核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，故完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)。核酸的分離和純化時(shí)應(yīng)遵循兩個(gè)原則：保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性-完整；排除其它分子的污染-純。分離核酸的一般原則143①核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；②其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時(shí)應(yīng)去除RNA，反之亦然。核酸的純度要求144①盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞；②減少化學(xué)物質(zhì)對(duì)核酸的降解，為避免過酸、過堿對(duì)核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH4～10條件下進(jìn)行；③防止核酸的生物降解。細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。其中DNA酶需要金屬二價(jià)陽離子Mg2+、Ca2+的激活，因此，使用金屬離子螯合劑，如EDTA或檸檬酸鹽等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布廣泛、極易污染樣品，且耐高溫、耐酸堿、不易失活，所以生物降解是RNA提取過程中的主要危害因素；核酸分離純化的注意事項(xiàng)145④減少物理因素對(duì)核酸的降解，物理降解因素主要是機(jī)械剪切力，其次是高溫。機(jī)械剪切力包括強(qiáng)力高速的溶液振蕩、攪拌；細(xì)胞突然置于低滲液中造成細(xì)胞破裂；DNA樣品的反復(fù)凍融等。機(jī)械剪切作用的主要危害對(duì)象是大分子量的線性DNA分子，如真核細(xì)胞的染色體DNA等。

高溫，如長時(shí)間煮沸，除水沸騰帶來的剪切力外，高溫本身對(duì)核酸分子中的某些化合鍵也有破壞作用。核酸分離純化的注意事項(xiàng)146核酸分離純化的一般步驟破碎細(xì)胞→去除蛋白質(zhì)、多糖、脂類等生物大分子→沉淀核酸→去除鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)→純化干燥→溶解。真核DNA與核蛋白共存，核蛋白溶于水或高鹽溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低鹽溶液（0.14mol/LNaCl）。去除蛋白質(zhì)：水飽和酚，氯仿異戊醇。DNA沉淀：0.3MNaAC-70%乙醇。147核酸的測(cè)定方法紫外吸收法：在一定pH下測(cè)定樣品的紫外吸光度（A260），即可由下式計(jì)算樣品中的核酸含量：其中：C為核酸的含量（mg/mL），Mr為相對(duì)分子質(zhì)量，A260為核酸溶液的吸光度，ε為摩爾消光系數(shù)（即1升溶液中含1摩爾核酸的光吸收值），L為比色杯的內(nèi)徑（cm）C=Mr×A260/ε×L148紫外吸收法：

1個(gè)A(1OD260)

～50μg/ml雙鏈DNA

～40μg/mlRNA或單鏈DNA核酸純度的測(cè)定：OD260／OD280

純DNA比值1.8，＜1.8蛋白、苯酚污染；純RNA比值2.0，<2.0DNA、蛋白、苯酚污染。149DNA&RNAGelelectrophoresis

核酸凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳150151152Polyacrylamidegels

（聚丙烯酰胺凝膠電泳）多用于分離1kb以下片段；Agarosegels（瓊脂糖凝膠電泳）多用于分離混合大小片段，可從幾百至約20kb實(shí)驗(yàn)室最常用Pulsed-fieldgelelectrophoresis（PFGE）,脈沖場(chǎng)凝膠電泳一種分離大分子DNA的方法可用來分離從10kb到10Mb的DNA分子。在普通的凝膠電泳中，大的DNA分子（>10kb）移動(dòng)速度接近，很難分離形成足以區(qū)分的條帶。在脈沖場(chǎng)凝膠電泳中，電場(chǎng)不斷在兩種方向（有一定夾角，而不是相反的兩個(gè)方向）變動(dòng)。DNA分子帶有負(fù)電荷，朝正極移動(dòng)。相對(duì)較小的分子在電場(chǎng)轉(zhuǎn)換后可較快轉(zhuǎn)變移動(dòng)方向，而較大的分子在凝膠中轉(zhuǎn)向較困難，因此小分子向前移動(dòng)的速度比大分子快。153溴乙錠能插入DNA分子的堿基對(duì)間形成復(fù)合物,在紫外線照射下溴乙錠發(fā)橘紅色熒光,熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比154AgaroseGelElectrophoresis

_+DNAisnegativelychargedfromthephosphatebackboneVisualizeDNAwithethidiumbromide溴乙錠–fluorescesorangeONLYwhenboundtoDNAAgarosemesh155Agelcanbestainedwithethidiumbromide,whichfluorescesanintenseorangewhenboundtodouble-helicalDNAmolecule.Abandcontainingonly50ngofDNAcanbereadilyseen.BandsorspotsofradioactiveDNAingelscanbevisualizedbyautoradiography.156TheelectrophoreticmobilityofaDNAfragmentisinverselyproportionaltothelogarithmofthenumberofbasepairs,uptoacertainlimit.157分子雜交(Hybridization)

不同來源的核酸分子變性后，合并在一起進(jìn)行復(fù)性，這時(shí)，只要這些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成堿基互補(bǔ)配對(duì)的片段，復(fù)性也會(huì)發(fā)生于不同來源的核酸鏈之間，即形成所謂的雜化雙鏈(hybridduplex)，這個(gè)過程稱為雜交(hybridization)。158159雜交可以發(fā)生于DNA與DNA之間，也可以發(fā)生于RNA與RNA之間或DNA與RNA之間160DNA的分子雜交技術(shù)161SouthernBlotting：toidentifyDNA1.belabeling,hybridization5.autoradiographyNorthernBlotting:toidentifyRNA162163164165原位分子雜交—鑒定特定基因mRNA表達(dá)（insituhybridization）熒光原位雜交—鑒定染色體

(FISH,Fluorescenceinsituhybridization)Southernblot—鑒定DNANorthernblot—鑒定RNAWesternblot—鑒定蛋白質(zhì)166SirEdwinSouthern167168169170限制性內(nèi)切酶171限制性內(nèi)切酶&連接酶雙鏈DNA分子可以被上千種從微生物中分離得到的限制性內(nèi)切酶（restrictionenzyme）切斷,又可以再連接起來。切斷的過程不需要能量，而連接的起來的過程卻需要2個(gè)分子的ATP。這就是分子克隆和DNA重組技術(shù)的基礎(chǔ)。172大部分限制性內(nèi)切酶識(shí)別的堿基序列均為6個(gè)堿基的palindrome順序。它們?cè)谖⑸锛?xì)胞內(nèi)扮演的卻是防御外來DNA入侵的作用。如何不把自身的DNA也降解了呢？173限制性內(nèi)切酶Restrictionendonucleases(Restrictionenzymes)限制性內(nèi)切酶第一個(gè)被分離和鑒定的限制性內(nèi)切酶是HindII.

5'GTYRAC3' Y=CorT 3'CARYTG5' R=AorG174Theendonucleaserecognizesthesamepalindromesequence（回文序列）

andcleavesatornearmethylaserecognitionsite.

Thesespecificnucleases,however,wouldnotcleaveatthesespecificpalindromicsequencesiftheDNAwasmethylated.Restrictionendonucleases

(Restrictionenzymes)1751978年Nobel生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)

RestrictionenzymesAfterisolatingthefirstrestrictionenzyme,HindII,in1970,andthesubsequentdiscoveryandcharacterizationofnumerousrestrictionendonucleases,the1978NobelPrizeforPhysiologyorMedicinewasawardedtoDanielNathans,WernerArber,andHamiltonO.Smith

"forthediscoveryofrestrictionenzymesandtheirapplicationtoproblemsofmoleculargenetics".1761978年Nobel生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)

RestrictionenzymesWernerArber(1929-)DanielNathans(1928-1999)HamiltonO.Smith(1931-)177Thiscombinationofaspecificmethylaseandendonucleasefunctionedasatypeofsmall-scaleimmunesystemforindividualbacterialstrains,protectingthemfrominfectionbyforeignDNA(e.g.viruses).

Formolecularbiologists:ToolstocutDNA178限制性內(nèi)切酶：分子生物學(xué)工具Restrictionendonucleasesarecommonlynamedafterthebacteriumfromwhichitwasisolated.Over100endonucleaseswithdifferentsequencespecificcleavagesites.TheyareoneoftheprimarytoolsinmodernmolecularbiologyforthemanipulationandidentificationofDNAsequences.179限制性內(nèi)切酶識(shí)別特定序列180其他結(jié)構(gòu)形式的DNAROTATORORNURSESRUN181Ifthereisa25%probabilityforaspecificbaseatanygivensite,thenthefrequencywithwhichdifferentrestrictionendonucleasesiteswilloccurcanbeeasilycalculated(0.25n):NucleotideSpecificityExampleFrequencyofOccurrenceFourAluI256(0.25Kb)FiveNciI1024(1.0Kb)SixEcoRI4096(4.1Kb)SevenEcoO109I16384(16.4Kb)EightNotI65536(65.5Kb)限制性內(nèi)切酶切割頻率182(Palindrome)183BluntendsorstickyEnds184Bluntends:平滑末端在兩條鏈的特定序列的相同部位切割，形成一個(gè)無粘性末端的平口。Stickyends:粘末端末端為含未配對(duì)堿基，能與具有互補(bǔ)堿基的目的基因片段的DNA連結(jié)，故稱為粘性末端。限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)條件反應(yīng)緩沖液條件:pH,saltconcentrationeg.Mg2+,DTT溫度:37C所需酶量:1unit=enzymeneededtocut1gofDNAinahour反應(yīng)完畢后要使酶失活185DNA重組技術(shù)

ConstructingnovelDNAmoleculesinthelaboratory186187vectorligationRecombinantDNAForeignDNARestrictiondigestion188PlasmidsarecircularmoleculesofDNAthatleadanindependentexistenceinthebacterialcells.Theyareaccessorychromosomes,anddispensable.plasmidsBacterialchromosomeForeignDNAcarriedbyvector

(plasmidorphage)189Plasmids（質(zhì)粒）TheplasmidsmostcommonlyusedinrecombinantDNAtechnologyreplicateinE.coli.Generally,theseplasmidshavebeenengineeredtooptimizetheiruseasvectorsinDNAcloning.MostplasmidvectorscontainlittlemorethantheessentialnucleotidesequencesrequiredfortheiruseinDNAcloning:areplicationorigin,adrug-resistancegene(selectablemarker),andaregioninwhichexogenousDNAfragmentscanbeinserted(polylinker).190191Ligation:連接DNA分子Stickyendsligation/Bluntendsligation192LigationreactionA