（優(yōu)選）干擾素生產(chǎn)工藝副本目前一頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點干擾素的理化性質(zhì)143-166aa；MW:18-40ku；；乙醚、氯仿敏感容易吸附玻璃、淀粉、醋酸纖維膜、瓊脂和塑料等介質(zhì)。目前二頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點工藝流程基因工程假單胞桿菌的構建搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體收集菌體裂解預處理-沉淀初級分離溶解粗干擾素沉淀

與疏水層析陰離子交換層析與濃縮陽離子交換層析與濃縮凝膠過濾層析無菌過濾分裝檢測

30℃，pH7.018±2h30℃，pH7.016000r/min離心2℃～10℃16000r/min目前三頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點干擾素生產(chǎn)工藝路線（1）體外誘生干擾素制備工藝：

Sendai病毒誘導人白細胞1989年：IFNα-n3/Alferon，批準上市產(chǎn)量低：1gIFNα，需要3億ml人血白細胞來源困難，工藝復雜，收率低，價格昂貴潛在的血源性病毒污染的可能性目前四頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點干擾素生產(chǎn)工藝路線（2）人源轉(zhuǎn)化細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：

1999年：IFNα-n1/Wellferon,批準用于臨床。優(yōu)點：首次實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。缺點：活性低，退出臨床應用。目前五頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點干擾素生產(chǎn)工藝路線（3）上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；

2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys表達產(chǎn)物：無糖基化，N-met，無活性包涵體工藝特點：發(fā)酵過程，隨后變性、復性過程?；蚬こ檀竽c桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:目前六頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點干擾素生產(chǎn)工藝路線（4）上市產(chǎn)品：rhuIFNβ-1a1996，Avonex(Biogen)；

2002，Rebif(Serono)表達產(chǎn)物：166aa糖基化蛋白，22.5ku工藝特點：分泌表達，產(chǎn)量低，成本高,過程嚴格動物無限細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：目前七頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點干擾素生產(chǎn)工藝路線（5）宿主：腐生型假單胞桿菌（Pseudomonasputida）上市產(chǎn)品：IFNα-2b/安福隆表達產(chǎn)物：無糖基化可溶性蛋白質(zhì)，具有天然分子結構和生物活性工藝特點：①發(fā)酵周期短（幾個小時）②無需變性、復性過程，獲得有活性產(chǎn)品純化過程：淘汰抗體親和層析基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝目前八頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點一、基因工程假單胞桿菌的構建

基因工程假單胞桿菌菌種建立基因工程假單胞桿菌菌種特性目前九頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點（一)-基因工程假單胞桿菌菌種建立第一步：干擾素α-2b基因的克隆第二步：表達載體的構建第三步：工程菌的構建目前十頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點第一步：干擾素基因的克隆(RT-PCR)

制備白細胞，病毒誘導，分離mRNA,反錄酶合成cDNA,PCR，基因連接質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化E.coli,篩選鑒定克隆。測序：編碼人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。目前十一頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點第二步：表達載體構建IFN基因與表達載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌篩選陽性克隆獲得序列正確表達載體目前十二頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點第三步：工程菌構建轉(zhuǎn)化假單胞桿篩選高表達、穩(wěn)定遺傳的工程菌獲得原始菌種目前十三頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點（二）基因工程菌的特性（1）具有宿主菌的特征：細菌：革蘭氏陰性菌，有莢膜，無芽孢，桿狀。菌落：直徑2.5-3.0mm，灰綠色半透明狀,粘稠。生化特性:Ser-，L-Val、D/L-Arg和L-Thr為（2）工程菌的特征：SmR、TcR、ApR（3）具有生產(chǎn)干擾素能力：放射性免疫學效價不低于2.0×109IU/L。目前十四頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點二、干擾素α-2b的發(fā)酵工藝過程目前十五頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點1、搖瓶培養(yǎng)取保存工作種子批菌種，室溫融化搖瓶培養(yǎng)：30℃，pH7.0，250r/min，18±2h檢測：OD值和發(fā)酵液雜菌檢查。目前十六頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點2、種子罐培養(yǎng)接種：接入50L種子罐，接種量10%。培養(yǎng)：30℃，pH7.0?？刂疲杭壜?lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，DO為30%，3～4h，OD>4.0。檢測：顯微鏡和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。目前十七頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點3、發(fā)酵罐培養(yǎng)接種：通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%?？刂疲杭壜?lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。前4h：30℃，pH7.0，DO為30%。4h后：20℃，pH6.0，DO為60%，5～6.5h。終點控制：OD值達9.0±1.0，5℃冷卻水快速降溫至15℃以下。檢測：發(fā)酵液雜菌檢查目前十八頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點4、菌體收集連續(xù)流離心機：冷卻的發(fā)酵液，16000r/min離心收集。菌體保存：－20℃冰柜，不超過12個月。檢測：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結構一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性。目前十九頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點

三、干擾素的分離純化工藝過程干擾素分離工藝過程干擾素的純化工藝過程目前二十頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點（一）干擾素α-2b分離工藝過程菌體裂解預處理初級分離目前二十一頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點(1)菌體裂解

裂解緩沖液：純化水配制，2℃～10℃（pH7.5）使用保護劑：EDTA，PMSF（苯甲基磺酰氟）破碎－20℃菌體：2厘米以下的碎塊攪拌：加裂解緩沖液，2℃～10℃，2hr凍融:細胞完全破裂，釋放干擾素。目前二十二頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點(2)預處理-沉淀加絮凝劑聚乙烯亞胺:2℃～10℃，攪拌45min，對菌體碎片進行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:2℃～10℃,攪拌15min，對菌體碎片、DNA等進行沉淀。目前二十三頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點(3)離心

連續(xù)流離心機：2℃～10℃，16000r/min收集上清液：含有重組干擾素蛋白質(zhì)雜質(zhì)沉淀：121℃、30min蒸汽滅菌,焚燒處理。目前二十四頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點（4）初級分離

鹽析:4M硫酸銨，2℃～10℃，攪勻,靜置過夜。離心：連續(xù)流離心機，16000r/min保存：收集沉淀，粗干擾素，4℃保存。目前二十五頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點（四）、干擾素純化工藝過程溶解粗干擾素沉淀與疏水層析陰離子交換層析與濃縮陽離子交換層析與濃縮凝膠過濾層析無菌過濾分裝目前二十六頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點

(1)溶解粗干擾素

配制純化緩沖液：超純水，pH7.5磷酸緩沖液，0.45μm濾器和10ku超濾系統(tǒng)，百級層流下收集。冷卻至2℃～10℃。檢查:緩沖液的pH值和電導值。溶解：2℃～10℃，勻漿，完全溶解。目前二十七頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點(2)沉淀與疏水層析

等電點沉淀（1）：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液。疏水層析：干擾素吸附在疏水層析柱中

除非疏水性蛋白洗脫與收集：0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）。目前二十八頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點等電點沉淀（2）：磷酸調(diào)節(jié)pH4.5，調(diào)節(jié)電導值40ms/cm，2℃～10℃，靜置過夜超濾：1000ku超濾膜過濾，除去大蛋白。透析除鹽：調(diào)整溶液pH8.0，電導值，10ku超濾膜，0.005M緩沖液。目前二十九頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點(3)陰離子交換層析與濃縮0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）平衡樹脂。鹽濃度線性梯度5～50ms/cm進行洗脫，配合SDS收集干擾素峰。濃縮：調(diào)整溶液和電導，10ku超濾膜，0.05M醋酸緩沖液（pH5.0）中透析。目前三十頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點（4)陽離子交換層析與濃縮用0.1M醋酸緩沖液（pH5.0）平衡樹脂。上樣，相同緩沖液沖洗。鹽濃度線性梯度5～50ms/cm進行洗脫配合SDS收集干擾素峰。濃縮：10ku超濾膜進行。目前三十一頁\總數(shù)三十四頁\編于二十點(5)凝膠過濾層析洗滌液：0.15MNaCl的0.01M磷酸緩沖液（pH7.0）清洗系統(tǒng)和樹脂上樣，相同緩沖液進