第十二章機體免疫功能的檢測技術(shù)詳解演示文稿目前一頁\總數(shù)八十八頁\編于十點優(yōu)選第十二章機體免疫功能的檢測技術(shù)目前二頁\總數(shù)八十八頁\編于十點第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離與純化一、白細(xì)胞的分離二、外周血單個核細(xì)胞的分離三、淋巴細(xì)胞及其亞群的分離四、其他細(xì)胞的分離和收集

返回目前三頁\總數(shù)八十八頁\編于十點1．自然沉降分離法2．聚合物加速沉淀法返回一、白細(xì)胞的分離血液中紅細(xì)胞與白細(xì)胞比例約600~1000:1目前四頁\總數(shù)八十八頁\編于十點上層：淡黃色血漿灰白層：白細(xì)胞底層：紅細(xì)胞返回1．自然沉降分離法室溫靜置30-60min目前五頁\總數(shù)八十八頁\編于十點2．聚合物加速沉淀法返回某些高分子聚合物（如明膠、右旋糖酐、甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮等）可使紅細(xì)胞凝聚成串，加速紅細(xì)胞沉降，使之更易與白細(xì)胞分離。目前六頁\總數(shù)八十八頁\編于十點1.Ficoll分層液法2.Percoll分層液法二、外周血單個核細(xì)胞的分離返回人外周血細(xì)胞的密度為：紅細(xì)胞1.093，粒細(xì)胞1.092，單個核細(xì)胞1.075～1.090，血小板1.030～1.035。目前七頁\總數(shù)八十八頁\編于十點1.Ficoll分層液法◆Ficoll分層液法即聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度離心分離法（ficoll-hypaquedensitygradientcentrifugation)◆聚蔗糖密度：1.020泛影葡胺密度：1.200◆外周血單個核細(xì)胞（PBMC）密度：人：1.077小鼠：1.088馬：1.090目前八頁\總數(shù)八十八頁\編于十點用Ficoll分離外周血單個核細(xì)胞返回95%2000rpm20min目前九頁\總數(shù)八十八頁\編于十點2.Percoll分層液法◆Percoll是聚乙烯吡咯烷酮包被的硅膠混懸液的商品名，為一種無細(xì)胞毒無刺激的新型密度梯度分層液?！鬚ercoll原液（密度1.135）+8.5%NaCl或1.5MPBS(9:1)Percoll濃度（%）706050403020比重（g/ml)1.0901.0771.0671.0561.0431.031目前十頁\總數(shù)八十八頁\編于十點用Percoll分離外周血單個核細(xì)胞返回75%98%血小板目前十一頁\總數(shù)八十八頁\編于十點三、淋巴細(xì)胞及其亞群的分離1.紅細(xì)胞的去除2.血小板的去除3.單核細(xì)胞的去除4.淋巴細(xì)胞亞群的分離返回目前十二頁\總數(shù)八十八頁\編于十點1.紅細(xì)胞的去除（1）低滲裂解法：蒸餾水（2）氯化銨處理法：0.83%氯化銨返回PBMC+1mlH2O輕輕振搖不超過1min加入等量1.8%生理鹽水去除紅細(xì)胞碎片目前十三頁\總數(shù)八十八頁\編于十點3.單核細(xì)胞的去除（1）粘附貼壁法：在玻璃或塑料平皿中于37℃溫箱靜置1h目前十四頁\總數(shù)八十八頁\編于十點玻璃纖維或葡聚糖凝膠吸附單核細(xì)胞，收集未吸附的淋巴細(xì)胞（2）吸附柱過濾法：單核細(xì)胞37℃1-2h淋巴細(xì)胞目前十五頁\總數(shù)八十八頁\編于十點（3）磁鐵吸引法：加入直徑為3um的羰基鐵顆粒，待單核細(xì)胞充分吞噬顆粒后，再用磁鐵將單核細(xì)胞吸至管底，上層液中則含有較純的淋巴細(xì)胞。返回目前十六頁\總數(shù)八十八頁\編于十點4.淋巴細(xì)胞亞群的分離（1）E-玫瑰花環(huán)沉降法（2）尼龍棉纖維分離法（3）親和分離法（4）抗體/補體介導(dǎo)的特異性細(xì)胞毒作用分離法（5）免疫磁珠分離法（6）流式細(xì)胞儀分離法返回目前十七頁\總數(shù)八十八頁\編于十點（1）E-玫瑰花環(huán)沉降法返回目前十八頁\總數(shù)八十八頁\編于十點（2）尼龍棉纖維分離法T細(xì)胞：不吸附B細(xì)胞：吸附T細(xì)胞(90%)B細(xì)胞(80%)37℃1-2h返回10-20%小牛血清培養(yǎng)液目前十九頁\總數(shù)八十八頁\編于十點（3）親和分離法返回目前二十頁\總數(shù)八十八頁\編于十點（4）抗體/補體介導(dǎo)的特異性細(xì)胞毒作用分離法返回在補體的作用下裂解與抗體結(jié)合的細(xì)胞，從而分離出不能與此抗體結(jié)合的細(xì)胞亞群。這是一種負(fù)選性分離法，簡稱細(xì)胞毒法。目前二十一頁\總數(shù)八十八頁\編于十點（5）免疫磁珠分離法PBMC+生物素標(biāo)記抗體+親和素標(biāo)記磁珠目前二十二頁\總數(shù)八十八頁\編于十點CD56MicroBeads:positiveselectionNKCellIsolationKit:negativeselection分離前分離后目前二十三頁\總數(shù)八十八頁\編于十點BrdUPBMCNK-depletedPBMC17.6%41%目前二十四頁\總數(shù)八十八頁\編于十點返回目前二十五頁\總數(shù)八十八頁\編于十點返回（6）流式細(xì)胞儀分離法目前二十六頁\總數(shù)八十八頁\編于十點四、其他細(xì)胞的分離和收集（一）巨噬細(xì)胞的分離和收集（二）NK細(xì)胞細(xì)胞的分離返回目前二十七頁\總數(shù)八十八頁\編于十點（一）吞噬細(xì)胞的分離和收集人：組織液（斑蝥敷貼法）濾紙蘸取10%中藥斑蝥酒精浸出液臂內(nèi)側(cè)皮膚48小時后局部形成水皰吸取皰中的組織液,內(nèi)含巨噬細(xì)胞目前二十八頁\總數(shù)八十八頁\編于十點返回小動物：腹腔巨噬細(xì)胞小鼠腹腔內(nèi)注入石蠟油３~４天后吸出腹腔浸出液70~80%為巨噬細(xì)胞目前二十九頁\總數(shù)八十八頁\編于十點（二）NK細(xì)胞的分離單核細(xì)胞:粘附法B細(xì)胞:尼侖棉纖維T細(xì)胞:E-玫瑰花環(huán)沉降法返回PBMCNK目前三十頁\總數(shù)八十八頁\編于十點第二節(jié)體液免疫功能的檢測一、免疫球蛋白的定量檢測二、B細(xì)胞數(shù)目及功能的檢測返回目前三十一頁\總數(shù)八十八頁\編于十點一、免疫球蛋白的定量檢測返回（1）單相免疫擴散試驗（2）雙相免疫擴散試驗（3）火箭電泳（4）中和反應(yīng)（5）ELISA目前三十二頁\總數(shù)八十八頁\編于十點單相免疫擴散試驗返回FLASH目前三十三頁\總數(shù)八十八頁\編于十點雙相免疫擴散試驗?zāi)壳叭捻揬總數(shù)八十八頁\編于十點雙相免疫擴散試驗返回FLASH目前三十五頁\總數(shù)八十八頁\編于十點（3）火箭電泳目前三十六頁\總數(shù)八十八頁\編于十點返回目前三十七頁\總數(shù)八十八頁\編于十點血清抗體病毒接種細(xì)胞或雞胚計算半數(shù)保護(hù)率（PD50）（4）中和反應(yīng)返回目前三十八頁\總數(shù)八十八頁\編于十點返回目前三十九頁\總數(shù)八十八頁\編于十點二、B細(xì)胞數(shù)目及功能的檢測1.外周血B細(xì)胞數(shù)目的檢測2.外周血B細(xì)胞功能的檢測返回目前四十頁\總數(shù)八十八頁\編于十點1.外周血B細(xì)胞數(shù)目的檢測◆免疫熒光技術(shù)◆花環(huán)試驗返回目前四十一頁\總數(shù)八十八頁\編于十點熒光顯微鏡目前四十二頁\總數(shù)八十八頁\編于十點返回CD19CD3流式細(xì)胞儀目前四十三頁\總數(shù)八十八頁\編于十點

B細(xì)胞EA、EAC玫瑰花環(huán)形成示意圖

返回目前四十四頁\總數(shù)八十八頁\編于十點2.外周血B細(xì)胞功能的檢測◆B細(xì)胞非特異性增殖◆抗體產(chǎn)生能力返回目前四十五頁\總數(shù)八十八頁\編于十點返回B細(xì)胞+刺激物（PWM，LPS）目前四十六頁\總數(shù)八十八頁\編于十點溶血空斑試驗?zāi)壳八氖唔揬總數(shù)八十八頁\編于十點酶聯(lián)免疫斑點試驗返回目前四十八頁\總數(shù)八十八頁\編于十點第三節(jié)細(xì)胞免疫功能的檢測一、T細(xì)胞亞群和數(shù)目的檢測二、T細(xì)胞功能的檢測三、其他免疫細(xì)胞功能的檢測返回目前四十九頁\總數(shù)八十八頁\編于十點一、T細(xì)胞亞群和數(shù)目的檢測2.免疫熒光技術(shù)1.花環(huán)試驗3.免疫酶細(xì)胞技術(shù)返回目前五十頁\總數(shù)八十八頁\編于十點返回玫瑰花環(huán)試驗正常范圍:60-80%E-花環(huán)形成率=形成花環(huán)的淋巴細(xì)胞數(shù)淋巴細(xì)胞總數(shù)(形成和未形成花環(huán)的細(xì)胞總數(shù))目前五十一頁\總數(shù)八十八頁\編于十點熒光顯微鏡目前五十二頁\總數(shù)八十八頁\編于十點返回流式細(xì)胞儀目前五十三頁\總數(shù)八十八頁\編于十點二、T細(xì)胞功能的檢測（一）體外功能實驗（二）體內(nèi)功能實驗返回目前五十四頁\總數(shù)八十八頁\編于十點（一）體外功能實驗1.淋巴細(xì)胞增殖試驗2.細(xì)胞毒試驗返回

51Cr釋放法

乳酸脫氫酶釋放法

細(xì)胞凋亡檢測法目前五十五頁\總數(shù)八十八頁\編于十點1.淋巴細(xì)胞增殖試驗非特異性刺激物（PHA、ConA）特異性刺激物（抗原）3H-TdR摻入法MTT法形態(tài)學(xué)計數(shù)法目前五十六頁\總數(shù)八十八頁\編于十點形態(tài)學(xué)計數(shù)法轉(zhuǎn)化細(xì)胞：體積大，染色質(zhì)疏松呈細(xì)網(wǎng)狀，核/細(xì)胞比例變小未轉(zhuǎn)化細(xì)胞：體積小，核染色體致密，核/細(xì)胞比例大目前五十七頁\總數(shù)八十八頁\編于十點轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)/淋巴細(xì)胞總數(shù)評價標(biāo)準(zhǔn)：60-80%為正常，50-59%為偏低，<50%為降低目前五十八頁\總數(shù)八十八頁\編于十點淋巴細(xì)胞+刺激物培養(yǎng)56h加入3H-TdR24h后收集細(xì)胞于玻璃纖維濾膜液閃儀測定放射性(cpm)刺激指數(shù)(SI)=刺激孔cpm/對照孔cpm3H-TdR摻入法正常值SI>2目前五十九頁\總數(shù)八十八頁\編于十點目前六十頁\總數(shù)八十八頁\編于十點MTT法[3-4,4-二甲基噻唑－2]，5－二苯基四氮唑溴鹽，簡稱MTT；線粒體的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物，經(jīng)鹽酸—異丙醇溶解后為藍(lán)色溶液；比色測定間接反映活細(xì)胞數(shù)量。返回刺激指數(shù)(SI)=刺激孔OD值/對照孔OD值目前六十一頁\總數(shù)八十八頁\編于十點51Cr釋放法殺傷率（%）=實驗孔cpm-自發(fā)釋放孔cpm最大釋放孔cpm-自發(fā)釋放孔cpm×100目前六十二頁\總數(shù)八十八頁\編于十點返回目前六十三頁\總數(shù)八十八頁\編于十點返回乳酸脫氫酶（LDH）釋放法CTL+靶細(xì)胞釋放LDH碘硝基氯化四氮唑（INT）紅色甲臜（farmazan）比活性測定（OD值）殺傷率（%）=實驗孔OD值-自發(fā)釋放孔OD值最大釋放孔OD值-自發(fā)釋放孔OD值×100目前六十四頁\總數(shù)八十八頁\編于十點靶細(xì)胞細(xì)胞凋亡檢測殺傷率%=（靶細(xì)胞對照孔細(xì)胞數(shù)-共培養(yǎng)孔靶細(xì)胞數(shù)）/靶細(xì)胞對照孔細(xì)胞數(shù)×100%效應(yīng)細(xì)胞+靶細(xì)胞細(xì)胞凋亡檢測法返回目前六十五頁\總數(shù)八十八頁\編于十點三、其他免疫細(xì)胞功能的檢測1.巨噬細(xì)胞功能的檢測3.NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞功能的檢測返回2.嗜中性粒細(xì)胞功能的檢測目前六十六頁\總數(shù)八十八頁\編于十點1.巨噬細(xì)胞功能的檢測炭粒廓清試驗吞噬功能的檢測巨噬細(xì)胞表面受體的檢測目前六十七頁\總數(shù)八十八頁\編于十點炭粒廓清試驗小鼠靜脈注射炭粒懸液測定血中炭粒的濃度血液中炭粒被廓清的速度目前六十八頁\總數(shù)八十八頁\編于十點巨噬細(xì)胞功能的檢測吞噬率=吞噬指數(shù)=吞噬紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)×100%吞噬紅細(xì)胞的總數(shù)

計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)37℃保溫0.5～1h目前六十九頁\總數(shù)八十八頁\編于十點返回

巨噬細(xì)胞EA、EAC玫瑰花環(huán)形成示意圖

MΦMΦ目前七十頁\總數(shù)八十八頁\編于十點目前七十一頁\總數(shù)八十八頁\編于十點

炎癥反應(yīng)的過程紅、腫、熱、痛目前七十二頁\總數(shù)八十八頁\編于十點嗜中性粒細(xì)胞趨化功能檢測返回目前七十三頁\總數(shù)八十八頁\編于十點目前七十四頁\總數(shù)八十八頁\編于十點外周血淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)過IL-2培養(yǎng)后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類新型殺傷細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞不需抗原致敏不受MHC限制性，無特異性LAK（lymphokineactivatedkillercells）目前七十五頁\總數(shù)八十八頁\編于十點NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞功能的檢測NK細(xì)胞的靶細(xì)胞：K562LAK細(xì)胞的靶細(xì)胞：LiBr返回目前七十六頁\總數(shù)八十八頁\編于十點皮膚試驗返回目前七十七頁\總數(shù)八十八頁\編于十點第四節(jié)細(xì)胞因子及其受體的檢測技術(shù)一、細(xì)胞因子測定的基本原理及方法二、細(xì)胞因子受體測定的基本原理及方法返回目前七十八頁\總數(shù)八十八頁\編于十點目前七十九頁\總數(shù)八十八頁\編于十點返回目前八十頁\總數(shù)八十八頁\編于十點細(xì)胞因子受體目前八十一頁\總數(shù)八十八頁\編于十點返回目前八十二頁\總數(shù)八十八頁\編于十點一、細(xì)胞因子測定的基本原理及方法1.生物活性檢測技術(shù)（依賴性細(xì)胞株、功能測定等）2.免疫學(xué)檢測技術(shù)（ELISA、RIA、FACS）3.分子生物學(xué)