1、掌握基本氨基酸結(jié)構(gòu)、分類、性質(zhì)以及肽概念特點，分離純化基本方法。

2、重點掌握蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)以及結(jié)構(gòu)和功效相互關(guān)系，蛋白質(zhì)分離純化方法、技術(shù)。本章學習重點新版生物化學蛋白質(zhì)第1頁第一節(jié)蛋白質(zhì)元素組成、分類及生物學功效

一、蛋白質(zhì)元素組成二、蛋白質(zhì)分類三、蛋白質(zhì)生物學功效新版生物化學蛋白質(zhì)第2頁

一、蛋白質(zhì)元素組成

蛋白質(zhì)是一類含氮有機化合物，除含有碳、氫、氧外，還有氮和少許硫。一些蛋白質(zhì)還含有其它一些元素，主要是磷、鐵、碘、鉬、鋅和銅等。這些元素在蛋白質(zhì)中組成百分比約為：

碳50％氫7％氧23％

氮16%

硫0—3％其它微量新版生物化學蛋白質(zhì)第3頁蛋白質(zhì)含氮量蛋白質(zhì)平均含氮量為16%，這是蛋白質(zhì)元素組成一個特點，也是凱氏（Kjedahl）定氮法測定蛋白質(zhì)含量計算基礎(chǔ)。所以，能夠依據(jù)生物樣品中含氮量來計算蛋白質(zhì)大約含量：蛋白質(zhì)含量=蛋白氮

6.256.25為蛋白質(zhì)系數(shù)，即1克氮所代表蛋白質(zhì)量（克數(shù)）新版生物化學蛋白質(zhì)第4頁三聚氰胺粉末不溶于冷水，溶于熱水，微溶于乙二醇、甘油、乙醇，不溶于乙醚、苯、四氯化碳,遇強酸或強堿水溶液水解。三聚氰胺含氮量高達66.6%

其實凱氏定氮法缺點并不難填補，只要多一道步驟即可：先用三氯乙酸處理樣品。三氯乙酸能讓蛋白質(zhì)形成沉淀，過濾后，分別測定沉淀和濾液中氮含量，就能夠知道蛋白質(zhì)真正含量和冒充蛋白質(zhì)氮含量。新版生物化學蛋白質(zhì)第5頁蛋白質(zhì)分子組成

經(jīng)酸、堿和酶處理蛋白質(zhì)，使其徹底水解得到產(chǎn)物為氨基酸，組成蛋白質(zhì)常見20種氨基酸中除脯氨酸外，均為-氨基酸：不變部分可變部分新版生物化學蛋白質(zhì)第6頁二、蛋白質(zhì)分類1、據(jù)分子形狀分2、據(jù)分子組成份3、據(jù)溶解度分4、據(jù)生物功效分球狀蛋白質(zhì)（globularprotein）*纖維狀蛋白質(zhì)（fibrousprotein）新版生物化學蛋白質(zhì)第7頁外形靠近球形或橢圓形，溶解性很好，細胞中大多數(shù)可溶性蛋白質(zhì)如胞質(zhì)酶類，屬于這類。

球狀蛋白質(zhì)（globularprotein）：新版生物化學蛋白質(zhì)第8頁分子類似纖維或細棒。大都是結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白，角蛋白等?？煞譃榭扇苄岳w維狀蛋白質(zhì)（如肌肉中肌球蛋白）和不溶性纖維狀蛋白質(zhì)（如膠原蛋白，角蛋白等）。*纖維狀蛋白質(zhì)（fibrousprotein）：新版生物化學蛋白質(zhì)第9頁簡單蛋白(simpleprotein)結(jié)合蛋白(conjugatedprotein)1、據(jù)分子形狀分2、據(jù)分子組成份3、據(jù)溶解度分4、據(jù)生物功效分新版生物化學蛋白質(zhì)第10頁簡單蛋白

又稱為單純蛋白質(zhì)；這類蛋白質(zhì)僅由氨基酸組成，不含其它化學成份。*清蛋白和球蛋白：albuminandglobulin廣泛存在于動物組織中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。*谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀堿中，后者可溶于70－80％乙醇中。*精蛋白和組蛋白：堿性蛋白質(zhì)，存在與細胞核中。*硬蛋白：存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織中，分為角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白。新版生物化學蛋白質(zhì)第11頁

結(jié)合蛋白

除氨基酸外，還含有其它化學成份（輔因子），如：*色蛋白：含色素物質(zhì)，如血紅蛋白、細胞色素等。*糖蛋白：含糖類物質(zhì)，如細胞膜中糖蛋白等。*脂蛋白：含脂類。，如血清-，-脂蛋白等。*核蛋白：含核酸結(jié)合而成，如核糖體。新版生物化學蛋白質(zhì)第12頁1、據(jù)分子形狀分2、據(jù)分子組成份3、據(jù)溶解度分4、據(jù)生物功效分

清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白等新版生物化學蛋白質(zhì)第13頁依據(jù)溶解度：清蛋白：又稱白蛋白。溶于水。如乳清蛋白、血清清蛋白球蛋白：微溶于水，溶于稀中性鹽溶液。如大豆球蛋白谷蛋白：不溶于水、醇及中性鹽溶液。但溶于稀酸、稀堿。如米、麥蛋白醇溶蛋白：不溶于水、溶于70-80%乙醇。如玉米蛋白另外還有精蛋白、組蛋白、硬蛋白等新版生物化學蛋白質(zhì)第14頁

酶、結(jié)構(gòu)蛋白、運輸?shù)鞍?、營養(yǎng)和儲存蛋白、收縮蛋白和運動蛋白、防御蛋白、調(diào)整蛋白1、據(jù)分子形狀分2、據(jù)分子組成份3、據(jù)溶解度分4、據(jù)生物功效分新版生物化學蛋白質(zhì)第15頁

三、蛋白質(zhì)生物學功效1、催化功效—

酶類2、結(jié)構(gòu)功效（膠原蛋白；韌帶中彈性蛋白；頭發(fā)、指甲和皮膚中不溶性角蛋白；蠶絲、蛛網(wǎng)）3、營養(yǎng)和儲存功效（卵清蛋白和牛奶中酪蛋白）4、運輸功效（血紅蛋白、肌紅蛋白）5、收縮或運動功效（骨骼肌收縮——肌動蛋白和肌球蛋白相對滑動結(jié)果）6、激素功效（胰島素）7、保護和防御功效（蛋白質(zhì)抗體和免疫球蛋白）8、接收和傳遞信息功效（受體蛋白）9、調(diào)整或控制細胞生長、分化和遺傳信息表示功效（組蛋白、阻遏蛋白）蛋白質(zhì)是生命活動物質(zhì)基礎(chǔ)，它參加了幾乎全部生命活動過程。新版生物化學蛋白質(zhì)第16頁小結(jié)第一節(jié)蛋白質(zhì)元素組成、分類及生物學功效

一、蛋白質(zhì)元素組成二、蛋白質(zhì)分類三、蛋白質(zhì)生物學功效新版生物化學蛋白質(zhì)第17頁第二節(jié)氨基酸（aminoacid）一、氨基酸分類二、氨基酸理化性質(zhì)三、氨基酸分離分析新版生物化學蛋白質(zhì)第18頁蛋白質(zhì)水解依據(jù)水解程度

完全水解氨基酸混合物

不完全水解大小不等肽和氨基酸

依據(jù)水解方法

酸水解：多數(shù)氨基酸穩(wěn)定，不引發(fā)消旋作用；Trp完全被破壞，羥基氨基酸部分分解，Gln和Asn酰胺基被水解下來。

堿水解：Trp穩(wěn)定；多數(shù)氨基酸被不一樣程度破壞，且產(chǎn)生消旋現(xiàn)象，Arg脫氨。酶水解：不產(chǎn)生消旋作用，也不破壞氨基酸，但需各種酶協(xié)同作用。新版生物化學蛋白質(zhì)第19頁水解方法反應(yīng)條件產(chǎn)物優(yōu)點缺點酸水解6MHCl或4MH2SO4共煮20hrsL-aa不引發(fā)消旋Trp被破壞；一部分羥基aa(Ser,Thr)被分解；Asn和Gln酰胺基被水解下來堿水解5MNaOH共煮20hrsL-aa和D-aa混合物不破壞Trp引發(fā)消旋；Arg脫氨基生成鳥氨酸酶水解生理溫度、pH肽段和氨基酸混合物不破壞aa不引發(fā)消旋酶解時間長新版生物化學蛋白質(zhì)第20頁蛋白質(zhì)氨基酸組成當前已發(fā)覺氨基酸有250各種。不過組成蛋白質(zhì)常見氨基酸只有20種，稱為基本氨基酸。各種蛋白質(zhì)所含20種常見氨基酸種類和數(shù)目各不相同?；蛘哒f，20種常見氨基酸不一樣排列次序組成了特定蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子中氨基酸組成與其性質(zhì)相關(guān)。另外蛋白質(zhì)分子中氨基酸組成及百分比與其結(jié)構(gòu)也有一定關(guān)系。

新版生物化學蛋白質(zhì)第21頁一、氨基酸分類依據(jù)是否組成蛋白質(zhì)分為：

1.蛋白質(zhì)中常見氨基酸

2.蛋白質(zhì)中稀有氨基酸

3.非蛋白氨基酸依據(jù)R側(cè)鏈極性分類依據(jù)R側(cè)鏈結(jié)構(gòu)分類從營養(yǎng)學角度分類新版生物化學蛋白質(zhì)第22頁1.常見蛋白質(zhì)氨基酸（20種）有對應(yīng)遺傳密碼。近年發(fā)覺谷胱甘肽過氧化物酶中存在硒代半胱氨酸，有證據(jù)表明此氨基酸由終止密碼UGA編碼，可能是第21種蛋白質(zhì)氨基酸。新版生物化學蛋白質(zhì)第23頁結(jié)構(gòu)通式（脯氨酸除外）

共同特點：L-型，羧基相連α-碳上連接-NH2，所以都是L-α-氨基酸。

不變部分可變部分新版生物化學蛋白質(zhì)第24頁

依據(jù)R基團極性20種常見氨基酸又分為(1)非極性R基團氨基酸：8種—AlaValLeuIlePheProTrpMet(2)極性不帶電荷R基團氨基酸：7種—GlySerThrTyrAsnGlnCys(3)帶負電荷R基團氨基酸：2種—AspGlu(4)帶正電荷R基團氨基酸：3種—LysArgHis

1、蛋白質(zhì)中常見氨基酸結(jié)構(gòu)新版生物化學蛋白質(zhì)第25頁(1)非極性R基團氨基酸

-氨基丙酸丙氨酸

Alanine新版生物化學蛋白質(zhì)第26頁(1)非極性R基團氨基酸

-氨基異戊酸丙氨酸

Alanine纈氨酸

Valine新版生物化學蛋白質(zhì)第27頁(1)非極性R基團氨基酸

-氨基異己酸丙氨酸

Alanine纈氨酸

Valine亮氨酸

Leucine新版生物化學蛋白質(zhì)第28頁

-氨基--甲基戊酸丙氨酸

Alanine纈氨酸

Valine亮氨酸

Leucine異亮氨酸

Ileucine(1)非極性R基團氨基酸新版生物化學蛋白質(zhì)第29頁(1)非極性R基團氨基酸

-氨基--苯基丙酸丙氨酸

Alanine纈氨酸

Valine亮氨酸

Leucine異亮氨酸Ileucine苯丙氨酸Phenylalanine新版生物化學蛋白質(zhì)第30頁

(1)非極性R基團氨基酸-吡咯烷基--羧酸丙氨酸

Alanine纈氨酸

Valine亮氨酸

Leucine異亮氨酸Ileucine苯丙氨酸

Phenylalanine脯氨酸

Proline新版生物化學蛋白質(zhì)第31頁(1)非極性R基團氨基酸

-氨基--吲哚基丙酸丙氨酸

Alanine纈氨酸

Valine亮氨酸

Leucine異亮氨酸Ileucine苯丙氨酸

Phenylalanine脯氨酸

Proline色氨酸

Tryptophan新版生物化學蛋白質(zhì)第32頁

(1)非極性R基團氨基酸-氨基--甲硫基丁酸丙氨酸

Alanine纈氨酸

Valine亮氨酸

Leucine異亮氨酸Ileucine苯丙氨酸

Phenylalanine(F)脯氨酸

Proline色氨酸Tryptophan(W)甲硫氨酸

Methionine新版生物化學蛋白質(zhì)第33頁R基疏水性大小

Ala＜Met＜Pro＜Val＜Leu＝Ile＜Phe＜Trp這類氨基酸R基疏水性在維持蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中起著主要作用。

特點：不易溶于水新版生物化學蛋白質(zhì)第34頁Pro是唯一一個α-亞氨基酸，它在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中含有極主要作用，普通出現(xiàn)在兩段α-螺旋之間拐角處。新版生物化學蛋白質(zhì)第35頁

(2)極性不帶電荷R基團氨基酸氨基乙酸甘氨酸

Glycine

新版生物化學蛋白質(zhì)第36頁(2)極性不帶電荷R基團氨基酸

-氨基--羥基丙酸甘氨酸

Glycine

絲氨酸

Serine新版生物化學蛋白質(zhì)第37頁

(2)極性不帶電荷R基團氨基酸-氨基--羥基丁酸甘氨酸

Glycine

絲氨酸

Serine蘇氨酸

Threonine新版生物化學蛋白質(zhì)第38頁

(2)極性不帶電荷R基團氨基酸-氨基--對羥苯基丙酸甘氨酸

Glycine

絲氨酸

Serine蘇氨酸

Threonine酪氨酸Tyrosine新版生物化學蛋白質(zhì)第39頁(2)極性不帶電荷R基團氨基酸

甘氨酸

Glycine

絲氨酸

Serine蘇氨酸

Threonine酪氨酸

Tyrosine天冬酰胺Asparagine新版生物化學蛋白質(zhì)第40頁(2)極性不帶電荷R基團氨基酸

甘氨酸

Glycine

絲氨酸

Serine蘇氨酸

Threonine酪氨酸

Tyrosine天冬酰胺

Asparagine谷氨酰胺

Glutamine新版生物化學蛋白質(zhì)第41頁(2)極性不帶電荷R基團氨基酸甘氨酸

Glycine

絲氨酸

Serine蘇氨酸

Threonine酪氨酸

Tyrosine天冬酰胺

Asparagine谷氨酰胺

Glutamine(Q)半胱氨酸

Cysteine

-氨基--巰基丙酸特點：這類氨基酸側(cè)鏈含極性基團，但在生理條件下不解離，易溶于水，R側(cè)鏈能與水形成氫鍵。新版生物化學蛋白質(zhì)第42頁Cys中R含巰基（-SH），兩個Cys巰基氧化生成二硫鍵，生成胱氨酸。二硫鍵在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有主要意義。

新版生物化學蛋白質(zhì)第43頁(3)帶負電荷R基團氨基酸

-氨基丁二酸天冬氨酸

Aspartate新版生物化學蛋白質(zhì)第44頁(3)帶負電荷R基團氨基酸

-氨基戊二酸天冬氨酸

Aspartate(D)谷氨酸

Glutamate(E)在生理條件下,側(cè)鏈羧基完全解離，帶負電荷。為酸性氨基酸。新版生物化學蛋白質(zhì)第45頁(4)帶正電荷R基團氨基酸，-二氨基己酸賴氨酸

Lysine新版生物化學蛋白質(zhì)第46頁(4)帶正電荷R基團氨基酸

-氨基--胍基戊酸賴氨酸

Lysine精氨酸

Arginine新版生物化學蛋白質(zhì)第47頁(4)帶正電荷R基團氨基酸

-氨基--咪唑基丙酸賴氨酸

Lysine(K)精氨酸

Arginine組氨酸

Histidine在生理條件下，側(cè)鏈解離，帶正電荷。為堿性氨基酸。新版生物化學蛋白質(zhì)第48頁另外，依據(jù)R側(cè)鏈化學結(jié)構(gòu)，20種常見氨基酸能夠分為：脂肪族氨基酸（15種）芳香族氨基酸（Phe,Tyr）雜環(huán)族氨基酸（Trp,His,Pro）新版生物化學蛋白質(zhì)第49頁從營養(yǎng)學角度分類：必需氨基酸和非必需氨基酸必需氨基酸：人和哺乳動物不可缺乏但又不能本身合成氨基酸，只能從食物中補充。包含8種（Ile、Met、Val、Leu、Trp、Phe、Thr、Lys）“一家寫兩三本書來”還有2種：Arg、His，人和哺乳動物即使能夠合成，但數(shù)量遠遠達不到機體需求，尤其是在胚胎發(fā)育以及嬰幼兒期間，基本上也是由食物中補充，稱為半必需氨基酸。注：植物和微生物能合成自己全部氨基酸。新版生物化學蛋白質(zhì)第50頁2.蛋白質(zhì)中幾個主要稀有氨基酸在少數(shù)蛋白質(zhì)中分離出一些不常見氨基酸，通常稱為稀有蛋白質(zhì)氨基酸。這些氨基酸都是由對應(yīng)基本氨基酸衍生而來。在遺傳上，不含有遺傳密碼。其中主要有4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、N-甲基賴氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。這些不常見蛋白質(zhì)氨基酸結(jié)構(gòu)以下。新版生物化學蛋白質(zhì)第51頁3.非蛋白氨基酸（200各種）

廣泛存在于各種細胞和組織中，呈游離或結(jié)合態(tài)，但并不存在于蛋白質(zhì)中一類氨基酸，大部分也是蛋白質(zhì)氨基酸衍生物。

H2N-CH2-CH2-COOHH2N-CH2-CH2-CH2-COOH-丙氨酸-氨基丁酸新版生物化學蛋白質(zhì)第52頁

非蛋白氨基酸存在意義：(1)作為細菌細胞壁中肽聚糖組分：D-GluD-Ala(2)作為一些主要代謝物前體或中間體:-丙氨酸、鳥氨酸（Orn）、胍氨酸（Cit）(3)作為神經(jīng)傳導化學物質(zhì)：-氨基丁酸(4)有些氨基酸只作為一個N素轉(zhuǎn)運和貯藏載體(5)殺蟲防御作用:如種子中高濃度刀豆氨酸和5-羥色氨酸能預(yù)防毛蟲危害，高精氨酸能抑制細菌生長。絕大部分非蛋白氨基酸功效不清楚。新版生物化學蛋白質(zhì)第53頁1.高熔點2.普通均溶于水，溶于強酸、強堿；不溶于乙醚。3.氨基酸普通有味：如大米香味（Cys)、啤酒苦味（Val、Leu、Ile）氨基酸兩個主要性質(zhì)：氨基酸晶體熔點高（200C）；氨基酸使水介電常數(shù)增高。二、氨基酸理化性質(zhì)（一）氨基酸普通物理性質(zhì)新版生物化學蛋白質(zhì)第54頁新版生物化學蛋白質(zhì)第55頁二、氨基酸理化性質(zhì)

除甘氨酸外，其它氨基酸含有一個手性-碳原子，所以都含有旋光性。（二）氨基酸光學性質(zhì)

1.氨基酸旋光性新版生物化學蛋白質(zhì)第56頁旋光性：旋光物質(zhì)使平面偏振光偏振面發(fā)生旋轉(zhuǎn)能力。使偏振面向右旋，稱右旋光物質(zhì)，記為“+”，使偏振面向左旋，稱左旋光物質(zhì)，記為“-”。氨基酸旋光性是由它們結(jié)構(gòu)決定。除甘氨酸外，其它氨基酸-C原子都與四個不一樣原子和基團連接，因而是不對稱C原子。手性中心（chiralcenter）：當一個C原子有四個不一樣取代基同它連接形成一個不對稱碳原子時，這個碳原子就是一個不對稱中心或稱做手性中心。新版生物化學蛋白質(zhì)第57頁2.氨基酸光吸收組成蛋白質(zhì)20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠紫外區(qū)(<220nm)都有光吸收。在近紫外區(qū)(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有光吸收能力。酪氨酸max＝275nm;苯丙氨酸max＝257nm;色氨酸max＝280nm;新版生物化學蛋白質(zhì)第58頁（三）氨基酸兩性解離性質(zhì)和等電點

1.氨基酸兼性離子形式（兩性離子）

HH3N-C-COO-

R+

兩性離子：在同一個氨基酸分子上帶有能給出質(zhì)子-NH3+正離子；能夠接收外界質(zhì)子-COO-負離子。即在同一氨基酸分子上含有等量正負兩種電荷。二、氨基酸理化性質(zhì)新版生物化學蛋白質(zhì)第59頁

在反應(yīng)中它能夠提供質(zhì)子，起酸作用：

N+H3NH2

RCCOO-RCCOO-+H+

HH

也能夠接收質(zhì)子，起堿作用：

N+H3N+H3RCCOO-+H+RCCOOHHH

所以氨基酸是兩性電解質(zhì)新版生物化學蛋白質(zhì)第60頁2.氨基酸兩性解離在不一樣pH條件下，兩性離子狀態(tài)也隨之發(fā)生改變。pH1710凈電荷+10-1

正離子兩性離子負離子

等電點pI（三）氨基酸兩性解離性質(zhì)和等電點新版生物化學蛋白質(zhì)第61頁3.氨基酸等電點及其計算

氨基酸等電點:當溶液pH為某一值時，氨基酸分子中所含-NH3+和-COO-數(shù)目恰好相等，凈電荷為0。這一pH值即為氨基酸等電點，簡稱pI。在等電點時，處于電場中氨基酸既不向正極也不向負極移動，即沒有電泳行為。新版生物化學蛋白質(zhì)第62頁丙氨酸解離方程COOHH3N+CHCH3

K1’

COO-H3N+CHCH3COO-H2N

CHCH3K’2K1’=Ala+Ala+–H+K2’=H+Ala+–Ala–+H+COO-H3N+CHCH3+H+Ala+Ala+Ala+Ala-丙氨酸在酸性溶液中，完全質(zhì)子化：K′1、K′2分別代表α-COOH和α-NH3+表觀解離常數(shù)，若側(cè)鏈R基有可解離基團，其表觀解離常數(shù)用K′R表示。新版生物化學蛋白質(zhì)第63頁當Ala處于pI時，[Ala+]=[Ala-][Ala+][H+][Ala+]*K2’K1’[H+]=--[H+]2=K1’K2’.pI=(pK’1+pK’2)/2所以，丙氨酸pI=(2.34+9.69)/2=6.02側(cè)鏈不含解離基團中性氨基酸，其等電點是它pK′1和pK′2算術(shù)平均值新版生物化學蛋白質(zhì)第64頁+H3NCHRCOOHpK2’=9.69+H3NCHRCOOH+H3NCHRCOO–pI=6.02pK1’=2.23H2NCHRCOO–+H3NCHRCOO–H2NCHRCOO–+H3NCHRCOO–01370.501.00.51.0HClNaOH

物質(zhì)表觀解離常數(shù)能夠用測定滴定曲線試驗方法求得。新版生物化學蛋白質(zhì)第65頁20種基本氨基酸中只有組氨酸咪唑基pK最靠近生理pH值（游離氨基酸中為6.00，在多肽鏈中為7.35），是在生理pH條件下唯一含有緩沖能力氨基酸。新版生物化學蛋白質(zhì)第66頁天冬氨酸解離方程COOHCHNH3CH2COOHCOO-CHNH3CH2COOHCOO-CHNH3CH2COO-COO-CHNH2CH2COO-+H+-H+-H+-H++H++H+K1’K2’KR’Asp+Asp+Asp-Asp2-pIAsp=(pK1’+pKR’)/2+++帶有可解離R基氨基酸，相當于三元酸，有3個pK。新版生物化學蛋白質(zhì)第67頁

賴氨酸：

H+OH-

COOHCOO-COO-COO-K’1K’2K’RH3N+CHH3N+CHH2NCHH2NCH2.188.9510.53(CH2)4(CH2)4(CH2)4(CH2)4N+H3N+H3N+H3NH2

Lys2+Lys+

Lys+-Lys-

pI=(pK2+pKR)/2=(8.95+10.53)=9.74新版生物化學蛋白質(zhì)第68頁氨基酸等電點計算:側(cè)鏈不含離解基團中性氨基酸，其等電點是它pK’1和pK’2算術(shù)平均值：pI=(pK’1+pK’2)/2

一樣，對于側(cè)鏈含有可解離基團氨基酸，其pI值也決定于兩性離子兩邊pK’值算術(shù)平均值。酸性氨基酸：pI=(pK’1+pK’

R-COO-

)/2

堿性氨基酸：pI=(pK’2+pK’R-NH2)/2新版生物化學蛋白質(zhì)第69頁

小結(jié)1.某氨基酸等電點即為該氨基酸兩性離子兩邊pK值和二分之一。2.在氨基酸等電點以上任何pH，AA帶凈負電荷，在電場中向正極移動；在氨基酸等電點以下任何pH，AA帶凈正電荷，在電場中向負極移動。3.在一定pH范圍中，溶液pH離AA等電點愈遠，AA帶凈電荷愈多。新版生物化學蛋白質(zhì)第70頁用途：慣用于氨基酸定性或定量分析。（四）氨基酸化學反應(yīng)茚三酮水合茚三酮1.與茚三酮反應(yīng)（弱酸加熱條件下-NH2和-COOH

共同參加反應(yīng)）新版生物化學蛋白質(zhì)第71頁脯氨酸與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)物：N+黃色化合物新版生物化學蛋白質(zhì)第72頁（四）氨基酸化學反應(yīng)2.與2、4-二硝基氟苯反應(yīng)(-NH2

參加反應(yīng))弱堿DNP-AA（黃色）DNFB+AA在堿性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不一樣DNP-氨基酸能夠用色譜法進行判定。新版生物化學蛋白質(zhì)第73頁+DNFB（dinitrofiuorobenzene）氨基酸弱堿中DNP-AA(黃色)+HF新版生物化學蛋白質(zhì)第74頁用途：能夠用來判定多肽或蛋白質(zhì)-NH2末端氨基酸.亦稱Sanger反應(yīng)2.與2、4-二硝基氟苯反應(yīng)DNFB+弱堿DNP-多肽DNP-蛋白+HF酸解DNP-AA+游離AA蛋白多肽新版生物化學蛋白質(zhì)第75頁在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）能夠與N-端氨基酸游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法優(yōu)點是丹磺酰-氨基酸有很強熒光性質(zhì)，檢測靈敏度能夠到達110-9mol。3.與丹磺酰氯反應(yīng)新版生物化學蛋白質(zhì)第76頁丹磺酰氨基酸含有強烈黃色熒光。此法優(yōu)點為靈敏性較高(比DNFB法提升100倍，樣品量小于1毫微克分子)及丹磺酰氨基酸穩(wěn)定性較高(對酸水解穩(wěn)定性較DNP-氨基酸高)，可用紙電泳或聚酰胺薄膜層析判定。新版生物化學蛋白質(zhì)第77頁+PITC弱堿中(400

C)苯硫乙內(nèi)酰脲(PTH-AA)(無水氫氟酸中)H+苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）4.與苯異硫氰酸酯反應(yīng)(-NH2

參加反應(yīng))新版生物化學蛋白質(zhì)第78頁

用途：能夠用來判定多肽或蛋白質(zhì)-NH2末端氨基酸.亦稱Edman反應(yīng)弱堿

PITC+多肽蛋白

PTC—多肽蛋白無水甲酸或HFPTH-AA+少一個AA多肽或蛋白4.與苯異硫氰酸酯反應(yīng)新版生物化學蛋白質(zhì)第79頁5.成肽反應(yīng)是多肽和蛋白質(zhì)生物合成基本反應(yīng)新版生物化學蛋白質(zhì)第80頁6．側(cè)鏈基團化學性質(zhì)(1)巰基（-SH）性質(zhì)作用：這些反應(yīng)可用于巰基保護。ICH2COOH新版生物化學蛋白質(zhì)第81頁（1）巰基（-SH）性質(zhì)作用：與金屬離子螯合性質(zhì)可用于體內(nèi)解毒對羥汞苯甲酸6．側(cè)鏈基團化學性質(zhì)新版生物化學蛋白質(zhì)第82頁(1)巰基（-SH）性質(zhì)作用：氧化還原反應(yīng)可使蛋白質(zhì)分子中二硫鍵形成或打開。胱氨酸6．側(cè)鏈基團化學性質(zhì)新版生物化學蛋白質(zhì)第83頁（2）羥基性質(zhì)作用：可用于修飾蛋白質(zhì)。二異丙基氟磷酸酯6．側(cè)鏈基團化學性質(zhì)新版生物化學蛋白質(zhì)第84頁（3）咪唑基性質(zhì)組氨酸含有咪唑基，它pK2值為6.0，在生理條件下含有緩沖作用。組氨酸中咪唑基能夠發(fā)生各種化學反應(yīng)。能夠與ATP發(fā)生磷?；磻?yīng)，形成磷酸組氨酸，從而使酶活化。組氨酸咪唑基也能發(fā)生烷基化反應(yīng)。生成烷基咪唑衍生物，并引發(fā)酶活性降低或喪失作用：判斷酶活性中心6．側(cè)鏈基團化學性質(zhì)新版生物化學蛋白質(zhì)第85頁三、氨基酸分離和分析判定1、分配層析2、離子交換層析3、高效液相色譜新版生物化學蛋白質(zhì)第86頁1.氨基酸紙層析新版生物化學蛋白質(zhì)第87頁2.離子交換層析新版生物化學蛋白質(zhì)第88頁3.高效液相色譜（HPLC）新版生物化學蛋白質(zhì)第89頁

小結(jié)AA分類

AA理化性質(zhì)

普通物理性質(zhì)

AA光吸收

AA兩性解離

AA化學反應(yīng)

AA分離分析新版生物化學蛋白質(zhì)第90頁第二章蛋白質(zhì)第一節(jié)蛋白質(zhì)化學組成第二節(jié)氨基酸第三節(jié)肽第四節(jié)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)第五節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功效關(guān)系第六節(jié)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)第七節(jié)蛋白質(zhì)分離純化與判定第八節(jié)蛋白質(zhì)組學介紹新版生物化學蛋白質(zhì)第91頁一、肽與肽鍵二、肽鏈中AA排列次序和命名三、肽主要理化性質(zhì)四、天然存在主要寡肽第三節(jié)肽（peptide）新版生物化學蛋白質(zhì)第92頁第三節(jié)肽（peptide）一個氨基酸羧基與另一個氨基酸氨基之間失水縮合形成酰胺鍵稱為肽鍵，所形成化合物稱為肽。一、肽與肽鍵由兩個氨基酸組成肽稱為二肽，由少于10個氨基酸組成肽稱為寡肽，由多于10個氨基酸組成肽稱為多肽。肽鏈中氨基酸單元稱為氨基酸殘基。新版生物化學蛋白質(zhì)第93頁NNCCαCαCαCOOHH肽平面肽平面肽平面：肽鏈中酰胺鍵及相鄰兩個Cα原子處于同一平面，組成折疊單位，稱為肽平面。肽鏈中肽平面包括原子形成主鏈骨架，稱主肽鏈。新版生物化學蛋白質(zhì)第94頁四肽結(jié)構(gòu)新版生物化學蛋白質(zhì)第95頁在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定次序排列，這種排列次序稱為氨基酸次序通常在多肽鏈一端含有一個游離-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個游離-羧基，稱為羧基端或C-端。習慣上將氨基末端寫在左側(cè)。氨基酸次序是從N-端氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點排列次序。肽鏈中氨基酸稱為氨基酰，如上述五肽可表示為：

Ser-Val-Tyr-Asp-Gln二、肽鏈中AA排列次序和命名新版生物化學蛋白質(zhì)第96頁三、肽主要理化性質(zhì)1.每種肽也有其晶體，晶體熔點都很高。2.在pH0-14范圍內(nèi)，肽酸堿性質(zhì)主要來自游離末端-NH2和游離末端-COOH以及側(cè)鏈上可解離基團。3.每一個肽都有其對應(yīng)等電點，計算方法與AA一致且復雜。4.肽化學反應(yīng)：也能發(fā)生茚三酮反應(yīng)、Sanger反應(yīng)和Edman反應(yīng)；還可發(fā)生雙縮脲反應(yīng)（是肽和蛋白質(zhì)所特有而氨基酸所沒有顏色反應(yīng)）。新版生物化學蛋白質(zhì)第97頁三、肽主要理化性質(zhì)雙縮脲是兩分子尿素經(jīng)加熱失去一分子NH3而得到產(chǎn)物。

雙縮脲能夠與堿性硫酸銅作用，產(chǎn)生藍色銅-雙縮脲絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。含有兩個以上肽鍵多肽，含有與雙縮脲相同結(jié)構(gòu)特點，也能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，生成紫紅色或藍紫色絡(luò)合物。這是多肽定量測定主要反應(yīng)。新版生物化學蛋白質(zhì)第98頁四、天然存在主要寡肽在生物體中有許多分子量比較小肽以游離狀態(tài)存在。它們含有各種特殊生理功效，常稱為活性肽（activepeptide）。如：谷胱甘肽;腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；蛇毒多肽等。新版生物化學蛋白質(zhì)第99頁谷胱甘肽——存在于動、植物及微生物中CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOHCH2CH2CHNH2COOHCH2SH1.參加體內(nèi)氧化還原反應(yīng)

2.作為輔酶參加氧化還原反應(yīng)保護巰基酶或含Cys蛋白質(zhì)中SH還原性

3.預(yù)防過氧化物積累

4.作為一個電子傳遞體參加植物體內(nèi)電子傳遞

GS-SG2GSH新版生物化學蛋白質(zhì)第100頁

L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val

L-OrnL-Orn

L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu

由細菌分泌多肽，有時也含有D-氨基酸和一些非蛋白氨基酸。如鳥氨酸（Ornithine,縮寫為Orn）。能抗革蘭氏陽性菌，對陰性細菌如綠膿桿菌、變性菌也有效。臨床上用于治療和預(yù)防化膿性病癥。

短桿菌肽S(環(huán)十肽)新版生物化學蛋白質(zhì)第101頁

能夠與真核生物RNA聚合酶和牢靠結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄進行。新版生物化學蛋白質(zhì)第102頁

腦啡肽

Met腦啡肽：Tyr—Gly—Gly—Phe—MetLeu腦啡肽：Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu

含有鎮(zhèn)痛作用，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中形成，是體內(nèi)產(chǎn)生一類鴉片劑。新版生物化學蛋白質(zhì)第103頁主要寡肽TyrCys

IleS

GlnS

AsnCys

Pro

LeuGly-NH2

TyrCys

PheS

GlnS

AsnCys

Pro

ArgGly-NH2

促進子宮肌收縮，含有催產(chǎn)作用。增加血壓牛催產(chǎn)素牛加壓素

牛催產(chǎn)素和牛加壓素只有2個氨基酸之差，生理作用竟然不一樣，對于分子更大蛋白質(zhì)來說，氨基酸排列、組合不一樣，其功效也是千差萬別?？梢?，結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)和功效。新版生物化學蛋白質(zhì)第104頁小結(jié)一、肽與肽鍵二、肽鏈中AA排列次序和命名三、肽主要理化性質(zhì)四、天然存在主要寡肽第三節(jié)肽新版生物化學蛋白質(zhì)第105頁第二章蛋白質(zhì)第一節(jié)蛋白質(zhì)化學組成第二節(jié)氨基酸第三節(jié)肽第四節(jié)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)第五節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功效關(guān)系第六節(jié)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)第七節(jié)蛋白質(zhì)分離純化與判定第八節(jié)蛋白質(zhì)組學介紹新版生物化學蛋白質(zhì)第106頁第四節(jié)：蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)二、蛋白質(zhì)構(gòu)象三、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)四、超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域五、蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)六、蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)新版生物化學蛋白質(zhì)第107頁

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽(polypeptide)鏈以特殊方式結(jié)合而成生物大分子。蛋白質(zhì)與多肽并無嚴格界限，通常是將分子量在6000道爾頓以上多肽稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量改變范圍很大,從大約6000到1,000,000道爾頓甚至更大。新版生物化學蛋白質(zhì)第108頁

一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)(構(gòu)象單元）超二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有不一樣層次：新版生物化學蛋白質(zhì)第109頁共價鍵次級鍵化學鍵

肽鍵一級結(jié)構(gòu)氫鍵二硫鍵二、三、四級結(jié)構(gòu)疏水鍵鹽鍵范德華力三、四級結(jié)構(gòu)新版生物化學蛋白質(zhì)第110頁a鹽鍵（離子鍵）b氫鍵c疏水相互作用力d范德華力e二硫鍵f酯鍵新版生物化學蛋白質(zhì)第111頁氫鍵雖是弱鍵，但數(shù)量極大，在維系蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中起主要作用，對維持三、四級結(jié)構(gòu)也起一定作用范德華引力是弱鍵，但數(shù)量大且含有加合性，對維持蛋白質(zhì)三、四級結(jié)構(gòu)起一定作用。蛋白質(zhì)分子中離子鍵數(shù)量較少，主要在側(cè)鏈起作用，參加維持蛋白質(zhì)三、四級結(jié)構(gòu)。另外，蛋白質(zhì)分子中二硫鍵（共價鍵）在穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象中也起主要作用。穩(wěn)定蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)作用力新版生物化學蛋白質(zhì)第112頁

疏水作用

疏水作用是指在水介質(zhì)中球狀蛋白質(zhì)折疊總是傾向于把疏水殘基埋藏在分子內(nèi)部。疏水作用是疏水基團或疏水側(cè)鏈出于避開水需要而被迫靠近。往往位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，對維系蛋白質(zhì)三、四級結(jié)構(gòu)起主要作用。新版生物化學蛋白質(zhì)第113頁龍蝦素（含鋅內(nèi)肽酶）新版生物化學蛋白質(zhì)第114頁半胱氨酸蛋白酶抑制劑新版生物化學蛋白質(zhì)第115頁

一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)

1.定義——1969年，國際純化學與應(yīng)用化學委員會（IUPAC）要求：多肽鏈中氨基酸排列次序稱為蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)。包含下述內(nèi)容：①蛋白質(zhì)分子多肽鏈數(shù)目；②每條肽鏈中氨基酸殘基種類、數(shù)目、排列次序；③鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵位置和數(shù)目。新版生物化學蛋白質(zhì)第116頁以胰島素(insulin)為例1）由A、B兩條鏈組成，（A鏈：21AA,B鏈：30AA）共計51個氨基酸殘基,Mr=57342）兩條鏈由兩個鏈間二硫鍵（A7-B7,A20-B19)連接，A鏈本身第6位和第11位2個Cys殘基之間形成一個鏈內(nèi)二硫鍵。胰島素是動物胰臟β細胞分泌一個分子量較小激素蛋白，主要功效是降低體內(nèi)血糖含量。英國Sanger等人于1953年首先完成了胰島素一級結(jié)構(gòu)測定工作。1958年取得諾貝爾化學獎新版生物化學蛋白質(zhì)第117頁

牛胰核糖核酸酶（RNase）

一條多肽鏈，124AA殘基組成，四個鏈內(nèi)二硫鍵，分子量12600。它是測出一級結(jié)構(gòu)第一個酶分子。新版生物化學蛋白質(zhì)第118頁

2.蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定蛋白質(zhì)氨基酸次序測定是蛋白質(zhì)化學研究基礎(chǔ)。自從1953年F.Sanger測定了胰島素一級結(jié)構(gòu)以來，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不一樣蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)被測定。

新版生物化學蛋白質(zhì)第119頁蛋白質(zhì)測序基本策略(1)直接法（測蛋白質(zhì)序列）

理想方法是從N端直接測至C端，但當前一次只能測幾十個氨基酸長度。所以必須將多肽鏈降解成較小肽段,然后分離,測每一個肽段氨基酸序列.

(2)間接法（測核酸序列推斷氨基酸序列）新版生物化學蛋白質(zhì)第120頁a、樣品必需純（>97%以上）；b、測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量。（用于估算氨基酸殘基數(shù)從而預(yù)計序列測定工作量大小）測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)前要求

分子質(zhì)量測定要求并不高，當前用物理化學方法測出分子質(zhì)量，誤差在10%左右就足夠了。慣用測定方法有：①凝膠過濾法；②SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法；③沉降分析法等新版生物化學蛋白質(zhì)第121頁1、凝膠過濾法原理：依據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小分離，在一定范圍內(nèi)蛋白質(zhì)分子量對數(shù)和洗脫體積之間成線性關(guān)系。Ve/Vo分子量對數(shù)新版生物化學蛋白質(zhì)第122頁新版生物化學蛋白質(zhì)第123頁SDS法測定分子量1)支持介質(zhì)聚丙烯酰胺(PAGE)－丙烯酰胺為單體，N，N－亞甲基雙丙烯酰胺作為交聯(lián)劑聚合而成具網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠；新版生物化學蛋白質(zhì)第124頁在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量十二烷基硫酸鈉（SDS），使蛋白樣品與SDS結(jié)合形成帶負電荷復合物，因為復合物分子量不一樣，在電泳中反應(yīng)出不一樣遷移率。依據(jù)標準樣品在該系統(tǒng)電泳中所作出標準曲線，推算出被測蛋白樣品分子量近似值。新版生物化學蛋白質(zhì)第125頁新版生物化學蛋白質(zhì)第126頁新版生物化學蛋白質(zhì)第127頁相對遷移率mR=樣品遷移距離（cm）/染料遷移距離（cm）點樣孔染料遷移距離樣品遷移距離新版生物化學蛋白質(zhì)第128頁㏒Mr=－b·mR+KMr為蛋白質(zhì)分子量mR為相對遷移率b為斜率K為截距。新版生物化學蛋白質(zhì)第129頁沉降速度法新版生物化學蛋白質(zhì)第130頁一級結(jié)構(gòu)測定步驟（1）

測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈數(shù)目

（2）拆分蛋白質(zhì)分子中多肽鏈（3）斷裂多肽鏈內(nèi)二硫鍵

（4）

測定多肽鏈氨基酸組成

（5）

分析多肽鏈N末端和C末端（6）多肽鏈部分裂解成肽段

（7）測定各個肽段氨基酸次序

（8）確定肽段在多肽鏈中次序

（9）確定多肽鏈中二硫鍵位置新版生物化學蛋白質(zhì)第131頁一級結(jié)構(gòu)測定步驟依據(jù)N末端或C末端殘基摩爾數(shù)和蛋白質(zhì)摩爾數(shù)（依據(jù)分子質(zhì)量計算）確定（1）

測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈數(shù)目

（2）拆分蛋白質(zhì)分子中多肽鏈（3）斷裂多肽鏈內(nèi)二硫鍵

（4）

測定多肽鏈氨基酸組成

（5）

分析多肽鏈N末端和C末端（6）多肽鏈部分裂解成肽段

（7）測定各個肽段氨基酸次序

（8）確定肽段在多肽鏈中次序

（9）確定多肽鏈中二硫鍵位置新版生物化學蛋白質(zhì)第132頁（2）拆分蛋白質(zhì)分子中多肽鏈測定步驟ssHCOOOHSO3HSO3H多肽鏈之間有兩種結(jié)合方式：

⑴非共價鍵結(jié)合：8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍⑵二硫鍵結(jié)合:

a.過甲酸氧化

b.β巰基乙醇還原：可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量-巰基乙醇處理,使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑（ICH2COOH）保護生成巰基，以預(yù)防它重新被氧化。（3）斷裂多肽鏈內(nèi)二硫鍵新版生物化學蛋白質(zhì)第133頁胰島素

-巰基乙醇碘乙酸新版生物化學蛋白質(zhì)第134頁（4）

測定多肽鏈氨基酸組成測定步驟完全水解，測定每種氨基酸含量，依據(jù)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量，能夠算出蛋白質(zhì)氨基酸組成（每摩爾蛋白質(zhì)中含氨基酸殘基摩爾數(shù)）,方便選擇用何種方法裂解蛋白質(zhì)。酸水解：6mol/L鹽酸或4mol/L硫酸在105-110℃條件下進行水解，反應(yīng)時間約10－24小時。缺點是Trp被沸酸完全破壞；含有羥基氨基酸如Ser、Thr、Tyr有一小部分被分解；Asn、Gln側(cè)鏈酰胺基被水解成了羧基。堿水解：用5mol/L氫氧化鈉煮沸20小時。該法優(yōu)點是色氨酸(Trp)在水解中不受破壞。酶解：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶。新版生物化學蛋白質(zhì)第135頁（5）

分析多肽鏈N末端和C末端測定步驟N-末端殘基:2,4-二硝基氟苯法丹磺酰氯法苯異硫氰酸酯法氨肽酶法C-末端殘基：肼解法羧肽酶法新版生物化學蛋白質(zhì)第136頁1、N端分析（氨基末端分析）①二硝基氟苯（FDNB）法FDNB新版生物化學蛋白質(zhì)第137頁②Edman降解法（苯異硫氰酸酯法）新版生物化學蛋白質(zhì)第138頁新版生物化學蛋白質(zhì)第139頁③丹磺酰氯（DNS-Cl）法乙酸乙酯抽提色譜判定新版生物化學蛋白質(zhì)第140頁④氨肽酶法氨肽酶是一個肽鏈外切酶，它能從多肽鏈N-端逐一向里水解。依據(jù)不一樣反應(yīng)時間測出酶水解所釋放出AA種類和數(shù)量，按反應(yīng)時間和氨基酸殘基釋放量作動力學曲線，從而知道PrN-末端殘基次序。最常用為亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端肽鍵速度最大。新版生物化學蛋白質(zhì)第141頁NH2－Phe－Glu－Leu…………..氨肽酶法測定N端氨基酸新版生物化學蛋白質(zhì)第142頁2、C-末端分析（羧基末端分析）①肼解法苯甲醛不溶于水DNFBDNFB-AA色譜分析判定水相新版生物化學蛋白質(zhì)第143頁②羧肽酶法NH2－Phe－Glu－Leu…………..COOH－Phe－Glu－Leu…………..~Leu－Glu－Phe－COOH新版生物化學蛋白質(zhì)第144頁羧肽酶種類：羧肽酶A羧肽酶B~Leu－Pro－Lys(ArgorPro)－COOH不能切割不能切割~Leu－Pro－Lys(Arg)－COOH能切割新版生物化學蛋白質(zhì)第145頁小結(jié):蛋白質(zhì)末端分析（N、C端）N末端分析二硝基氟苯（FDNB）法Edman降解法丹磺酰氯（DNS-Cl）法氨肽酶法C末端分析肼解法羧肽酶新版生物化學蛋白質(zhì)第146頁測定步驟（6）多肽鏈斷裂成多個肽段

可采取兩種或各種不一樣斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。A1A2A3A4B1B2B3新版生物化學蛋白質(zhì)第147頁

酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶多肽鏈選擇性降解

化學法：溴化氰，羥胺新版生物化學蛋白質(zhì)第148頁Trypsinase

：R1=Lys和Arg側(cè)鏈（專一性較強，水解速度快）。R2=Pro水解受抑。肽鏈水解位點胰蛋白酶新版生物化學蛋白質(zhì)第149頁或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=Phe,Trp,Tyr;Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro水解受抑。肽鏈水解位點糜蛋白酶新版生物化學蛋白質(zhì)第150頁Pepsin：R1和R2＝Phe,Trp,Tyr;Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度較快。R1=Pro水解受抑。肽鏈水解位點胃蛋白酶新版生物化學蛋白質(zhì)第151頁thermolysin：R2=Phe,Trp,Tyr;Leu，Ile,Met以及其它疏水性強氨基酸水解速度較快。R2=Pro或Gly水解受抑。肽鏈水解位點嗜熱菌蛋白酶新版生物化學蛋白質(zhì)第152頁分別從肽鏈羧基端和氨基端水解肽鏈水解位點羧肽酶和氨肽酶新版生物化學蛋白質(zhì)第153頁谷氨酸蛋白酶：R1=Glu、Asp(磷酸緩沖液)R1=Glu(磷酸緩沖液或醋酸緩沖液)精氨酸蛋白酶：R1=Arg肽鏈水解位點谷氨酸蛋白酶和精氨酸蛋白酶新版生物化學蛋白質(zhì)第154頁

化學法：可取得較大肽段溴化氰(Cyanogenbromide)水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸羧基所形成肽鍵。新版生物化學蛋白質(zhì)第155頁

羥胺（NH2OH）：專一性斷裂-Asn-Gly-之間肽鍵。也能部分裂解-Asn-Leu-之間肽鍵以及-Asn-Ala-之間肽鍵。新版生物化學蛋白質(zhì)第156頁一級結(jié)構(gòu)測定步驟Edman法（1）

測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈數(shù)目

（2）拆分蛋白質(zhì)分子中多肽鏈（3）斷裂多肽鏈內(nèi)二硫鍵

（4）

測定多肽鏈氨基酸組成

（5）

分析多肽鏈N末端和C末端（6）多肽鏈部分裂解成肽段

（7）測定各個肽段氨基酸次序

（8）確定肽段在多肽鏈中次序

（9）確定多肽鏈中二硫鍵位置新版生物化學蛋白質(zhì)第157頁蛋白質(zhì)測序方法氨基酸序列分析儀-化學測序（Edman反應(yīng)原理）酶降解法（氨肽酶、羧肽酶）質(zhì)譜法（MS）—

首先修飾肽鏈中極性基團，如氨基乙?；ù姿狒?、OH、COOH等甲基化（CH3I）。經(jīng)質(zhì)譜儀取得蛋白質(zhì)氣相離子

MS/MS測序普通在25AA左右

適于微量多肽<10-12mol依據(jù)核苷酸序列推定法

用待測蛋白作抗原免疫動物取得抗體，用抗體沉淀合成此蛋白核糖體，從中分離mRNAcDNA推測蛋白質(zhì)序列新版生物化學蛋白質(zhì)第158頁電噴射電離新版生物化學蛋白質(zhì)第159頁新版生物化學蛋白質(zhì)第160頁新版生物化學蛋白質(zhì)第161頁

利用兩套或多套肽段氨基酸次序彼此間交織重合（跨切口重合），拼湊出整條多肽鏈氨基酸次序。一級結(jié)構(gòu)測定步驟（1）

測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈數(shù)目

（2）拆分蛋白質(zhì)分子中多肽鏈（3）斷裂多肽鏈內(nèi)二硫鍵

（4）

測定多肽鏈氨基酸組成

（5）

分析多肽鏈N末端和C末端（6）多肽鏈部分裂解成肽段

（7）測定各個肽段氨基酸次序

（8）確定肽段在多肽鏈中次序

（9）確定多肽鏈中二硫鍵位置新版生物化學蛋白質(zhì)第162頁A法水解得到四個小肽：

A1Ala-PheA2Gly-Lys-Asn-TyrA3Arg-TyrA4His-Val重合結(jié)構(gòu)拼湊情況：A1Ala-PheB1Ala-Phe-Gly-LysA2Gly-Lys-Asn-TyrB2Asn-Tyr-ArgA3Arg-TyrB3Tyr-His-ValA4His-ValB法水解得到3個小肽：

B1Ala-Phe-Gly-LysB2Asn-Tyr-ArgB3Tyr-His-Val新版生物化學蛋白質(zhì)第163頁一級結(jié)構(gòu)測定步驟（1）

測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈數(shù)目

（2）拆分蛋白質(zhì)分子中多肽鏈（3）斷裂多肽鏈內(nèi)二硫鍵

（4）

測定多肽鏈氨基酸組成

（5）

分析多肽鏈N末端和C末端（6）多肽鏈部分裂解成肽段

（7）測定各個肽段氨基酸次序

（8）確定肽段在多肽鏈中次序

（9）確定多肽鏈中二硫鍵位置新版生物化學蛋白質(zhì)第164頁普通采取胃蛋白酶處理含有二硫鍵多肽鏈(切點多；酸性環(huán)境下預(yù)防二硫鍵發(fā)生交換)。將所得肽段利用Brown及Hartlay對角線電泳技術(shù)進行分離。然后同其它方法分析肽段進行比較，確定二硫鍵位置。新版生物化學蛋白質(zhì)第165頁+-+-第二向第一向abBrown和Hartlay對角線電泳圖解pH6.5圖中a、b兩個斑點是由一個二硫鍵斷裂產(chǎn)生肽段新版生物化學蛋白質(zhì)第166頁3、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測序意義判斷蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)洞悉蛋白質(zhì)功效有利于疾病診療與治療新版生物化學蛋白質(zhì)第167頁蛋白質(zhì)含有一條或數(shù)條多肽鏈,但并不是渙散。而是在三維空間上有特定走向和排布，即有特定空間結(jié)構(gòu)（三維結(jié)構(gòu)），這種空間結(jié)構(gòu)就是蛋白質(zhì)構(gòu)象。

二、蛋白質(zhì)構(gòu)象新版生物化學蛋白質(zhì)第168頁二、蛋白質(zhì)構(gòu)象（一）構(gòu)型與構(gòu)象1.構(gòu)型：是指不對稱碳原子上相連各原子或取代基團空間排布。構(gòu)型轉(zhuǎn)變必定伴伴隨共價鍵斷裂和重組。2.構(gòu)象：指相同構(gòu)型化合物中，與碳原子相連各原子或取代基團在單鍵旋轉(zhuǎn)時形成相對空間排布。構(gòu)象改變不需要共價鍵斷裂。新版生物化學蛋白質(zhì)第169頁二、蛋白質(zhì)構(gòu)象（二）蛋白質(zhì)構(gòu)象

蛋白質(zhì)構(gòu)象即蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)，是指在一級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，蛋白質(zhì)分子多肽鏈按一定方式折疊、盤繞或組裝成特有空間結(jié)構(gòu)。新版生物化學蛋白質(zhì)第170頁新版生物化學蛋白質(zhì)第171頁

肽鍵（peptidebond）肽鍵特點是氮原子上孤對電子與羰基含有顯著共軛作用。肽鍵中C-N鍵含有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。在大多數(shù)情況下，以反式結(jié)構(gòu)存在。組成肽鍵原子處于同一平面。C=N

0.127nm鍵長=0.132nmC-N

0.148nm新版生物化學蛋白質(zhì)第172頁肽平面：組成肽鍵四個原子（C、O、N、H）和與之相連兩個α碳原子都處于同一個平面內(nèi)，此剛性結(jié)構(gòu)平面稱肽平面或酰氨平面。相鄰肽平面組成二面角新版生物化學蛋白質(zhì)第173頁酰胺平面與α-碳原子二面角（φ和ψ

）

二面角

兩相鄰酰胺平面之間，能以共同Cα為定點而旋轉(zhuǎn)，繞Cα-N鍵旋轉(zhuǎn)角度稱φ角，繞C-Cα鍵旋轉(zhuǎn)角度稱ψ角。φ和ψ稱作二面角，亦稱構(gòu)象角。新版生物化學蛋白質(zhì)第174頁完全伸展多肽主鏈構(gòu)象α-碳原子酰胺平面Φ=1800，ψ=1800Φ=00，ψ=00多肽主鏈構(gòu)象酰胺平面Φ=00，ψ=00側(cè)鏈非鍵合原子接觸半徑新版生物化學蛋白質(zhì)第175頁新版生物化學蛋白質(zhì)第176頁

從理論上講，蛋白質(zhì)中全部Cα-C和Cα-N單鍵都能自由旋轉(zhuǎn)而形成無數(shù)構(gòu)象，但天然蛋白質(zhì)分子中只存在少數(shù)構(gòu)象，其原因是：

1、肽平面只能以Cα為頂點旋轉(zhuǎn)；

2、分子中原子以反式排列最為穩(wěn)定；

3、R側(cè)鏈基團空間位阻效應(yīng)。新版生物化學蛋白質(zhì)第177頁三、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)二級(Secondary)結(jié)構(gòu)是指肽鏈主鏈在空間排列,或規(guī)則幾何走向、旋轉(zhuǎn)及折疊。它只包括肽鏈主鏈構(gòu)象及鏈內(nèi)或鏈間形成氫鍵。主要有-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲。維系蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)力：氫鍵新版生物化學蛋白質(zhì)第178頁α-螺旋結(jié)構(gòu)是Pauling等人1951年提出。二面角：Φ=-57°Ψ=-47°是蛋白質(zhì)中最常見、含量最豐富二級結(jié)構(gòu)，在球狀及纖維狀蛋白質(zhì)中廣泛存在。1、α-螺旋（α－h(huán)elix）新版生物化學蛋白質(zhì)第179頁特征：1、每隔3.6個AA殘基螺旋上升一圈，螺距0.54nm;兩個氨基酸之間距離為0.15nm;2、螺旋體中全部氨基酸殘基R側(cè)鏈都伸向外側(cè)，鏈中全部>C=O和>N-H幾乎都平行于螺旋軸;3、每個氨基酸殘基>N-H與前面第四個氨基酸殘基>C=O形成氫鍵，肽鏈上全部肽鍵都參加氫鍵形成。

4、多肽鏈中存在脯氨酸時，α-螺旋中止，并產(chǎn)生一個“結(jié)節(jié)”

（1）

α－螺旋（α－h(huán)elix）新版生物化學蛋白質(zhì)第180頁CHCH2CH2CH2=-57、=-48新版生物化學蛋白質(zhì)第181頁形成原因：與ＡＡ組成和排列次序直接相關(guān)。多態(tài)性：多數(shù)為右手（較穩(wěn)定），亦有少數(shù)左手螺旋存在（不穩(wěn)定）；存在尺寸不一樣螺旋。

慣用3.613-螺旋代表α-螺旋，3.6指每圈螺旋包含3.6個氨基酸殘基，13表示氫鍵封閉環(huán)內(nèi)含有13個原子。其它螺旋形式：310-螺旋和π-螺旋（4.416—螺旋）新版生物化學蛋白質(zhì)第182頁right-handedhelixleft-handedhelix新版生物化學蛋白質(zhì)第183頁R側(cè)鏈對α-螺旋影響:

R側(cè)鏈大小和帶電性決定了能否形成α-螺旋以及形成α-螺旋穩(wěn)定性。

①

多肽鏈上連續(xù)出現(xiàn)帶同種電荷基團氨基酸

殘基，則因為靜電排斥，不能形成鏈內(nèi)氫鍵，從而不能形成穩(wěn)定α-螺旋。②

GlyΦ角和Ψ角可取較大范圍，在肽中連續(xù)存在時，使形成α-螺旋所需二面角機率很小，不易形成α-螺旋。③

R基大（如Ile）不易形成α-螺旋

④

Pro中止α-螺旋。

⑤

R基較小，且不帶電荷氨基酸利于α-螺旋形成。

新版生物化學蛋白質(zhì)第184頁（2）-折疊

-pleatedsheet也是1951年P(guān)auling等人提出。β-折疊片特點：多肽鏈主鏈處于較伸展波折形式（鋸齒狀），相鄰肽鏈之間或同一肽鏈不一樣肽段借助氫鍵彼此連成片狀結(jié)構(gòu)（主鏈N－H和C=0之間形成氫鍵）。氫鍵與肽鏈長軸靠近垂直。側(cè)鏈R基交替地分布在片層平面兩側(cè)。新版生物化學蛋白質(zhì)第185頁-折疊有兩種類型。一個為平行式，即全部肽鏈N-端都在同一邊。另一個為反平行式，即相鄰兩條肽鏈方向相反。反平行重復周期（肽鏈同側(cè)兩個相鄰同一基團之間距離）為0.7nm，平行為0.