植物組織培養(yǎng)風(fēng)景園林系

宗樹斌

Tel目九蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)學(xué)習(xí)目標(biāo)

了解蝴蝶蘭、蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)及蝴蝶蘭組培快繁情況；

掌握蝴蝶蘭組培快繁主要途徑——無菌播種和花梗腋芽快繁的步驟、方法；

熟悉蝴蝶蘭的其他快繁途徑及其他蘭花的組培快繁情況。主要內(nèi)容

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1、種子無菌播種

2、花梗腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

3、其它外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)討論：蝴蝶蘭組培外植體的選擇知識拓展：其它蘭花的組培技術(shù)相關(guān)閱讀

認(rèn)識蝴蝶蘭蝴蝶蘭(Phalaenopsishybrid)屬蘭科(Orchidaceae)蝴蝶蘭屬(Phalaenopsis)植物。其花形奇特，姿態(tài)優(yōu)雅，色彩鮮艷，花期長久，素有“蘭花皇后”之美譽，觀賞價值極高。

蝴蝶蘭為典型的單莖性熱帶附生蘭,植株很少發(fā)生側(cè)枝,分株繁殖系數(shù)極低;其種子內(nèi)不含胚乳,自然條件下很難萌發(fā),發(fā)芽率極低,故自身的營養(yǎng)繁殖和種子繁殖均難以滿足大量繁殖的需要。組織培養(yǎng)和無菌播種是其大量繁殖的重要手段。應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行蝴蝶蘭快速繁殖可以縮短繁育周期,獲得大量成株,并且可以保持優(yōu)良性狀,維護(hù)種質(zhì)資源。

蝴蝶蘭組織培養(yǎng)快速繁殖主要通過兩條途徑：一是利用種子無菌發(fā)芽，二是從離體器官誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖，通過原球莖的增殖培養(yǎng)，得到大量幼苗。

蝴蝶蘭的工業(yè)化生產(chǎn)十分成功，通過組織培養(yǎng)技術(shù)和無菌播種技術(shù)大規(guī)模繁殖種苗，最后作為盆花和切花銷售，在蘭花市場上占有相當(dāng)大的比例。近幾年來，隨著我國經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，蘭花業(yè)非?；馃?，國內(nèi)建立了許多大型蘭花生產(chǎn)和經(jīng)營公司，均以生產(chǎn)蝴蝶蘭為主。

1、種子無菌播種討論：種子無菌播種組培的優(yōu)缺點1.1授粉1.2果實采收與接種1.3種子苗的培養(yǎng)1.1授粉蝴蝶蘭在開花后4~6天進(jìn)行授粉的成功率最高。授粉時的溫度、光照對授粉成功與否有較大的影響。用于授粉的花粉必須為鮮黃色，粘性好，松散而不板結(jié)，最好用剛開花的花粉。若花粉變成深黃色至黃褐色，壓之不會散開，這樣的花粉進(jìn)行授粉通常不能成功。用于授粉的花粉必須為鮮黃色（右），深黃色（左）難成功。授粉用工具取開花4-6天的花朵為母本去掉其蕊株上的花藥將其唇瓣去掉取新鮮的父本花粉蝴蝶蘭花的構(gòu)造？將花粉放入蕊柱的穴腔中授粉2-3天后，蕊柱膨大、花瓣與萼片凋謝授粉3-4個月后，子房膨大，果莢可用于無菌播種一定要待果實成熟后采摘。1.2果實采收和播種

授粉成功的花朵3~4個月后果莢便可進(jìn)行試管無菌播種。將采收的蝴蝶蘭果莢用75﹪酒精擦洗干凈，用0.1﹪的HgCl2消毒8~10分鐘，用無菌水沖洗5次，吸干。用刀片將果莢內(nèi)細(xì)如粉塵的種子取出，置于花寶1號+香蕉50克∕升+乳蛋白2克∕升+蔗糖20克∕升+瓊脂8克∕升的培養(yǎng)基中。每個果莢可接種的瓶數(shù)？種子數(shù)量？1.3種子苗的轉(zhuǎn)接培養(yǎng)

播種15天可見淡綠色的已膨大了的胚，50~60天行成1.5~2毫米的原球莖。然后，轉(zhuǎn)至花寶1號或MS+BA1毫克∕升的培養(yǎng)基中，50~60天后長成2~3片葉的小苗。再轉(zhuǎn)至花寶1號生根培養(yǎng)基中，約60天后長成葉片間距6~8厘米的完整小苗。因此，蝴蝶蘭播種至出瓶約需5~6個月。2花梗腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

2.1取外植體

2.2初代培養(yǎng)

2.3繼代培養(yǎng)

2.4生根培養(yǎng)

2.5馴化移栽2.1取外植體

取材部位：在將開花的植株上，當(dāng)花梗抽出15cm左右時，取材較為適宜。

剪取15cm左右的花梗消毒與接種

在溫室中，剪取整枝花梗，經(jīng)流水沖洗后，首先用10％次氯酸鈉溶液表面消毒5min，無菌水沖洗干凈，然后剝?nèi)プ钔庖粚影~，再用5％次氯酸鈉溶液消毒15min，無菌水沖洗干凈后，將花梗剪成長約2cm帶腋芽的切段，基部向下插入MS十BA3.0-5.0mg/L的培養(yǎng)基上。初代培養(yǎng)接種的培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)瓶的選擇？2.2初代培養(yǎng)

花梗腋芽的培養(yǎng)，要求溫度25-28℃，光照度1000-20001x，光照10h／d，培養(yǎng)基中蔗糖30g/L、瓊脂6g/L。

3-4周后腋芽明顯膨大變綠，6-8周后腋芽生長成為小植株，并在基部開始生有叢生芽。

花梗腋芽培養(yǎng)技術(shù)流程流水沖洗10%次氯酸鈉5min無菌水沖洗干凈剝?nèi)プ钔鈱影~5%次氯酸鈉15min無菌水沖洗干凈剪取2cm帶腋芽切段基部向下插入MS+BA3-5mg/L溫度25-28℃,光照度1000-20001x，光照10h／d培養(yǎng)剪取15cm左右的花梗

2.3繼代培養(yǎng)花梗腋芽培養(yǎng)生成的叢生芽，經(jīng)55—60d的培養(yǎng)，花梗基部和培養(yǎng)基逐漸變黑，這時將叢生芽切下轉(zhuǎn)接到MS十BA3.0-5.0mg/L的培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，約50d后可生成新的叢生芽，增殖倍數(shù)為3—4。

繼代代數(shù)有什么決定？

繼代接種技術(shù)要點？2.4生根培養(yǎng)當(dāng)原球莖繼代增殖到一定數(shù)量后，原球莖在繼代培養(yǎng)基中或轉(zhuǎn)移到生根育苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)，均可分化出芽，并逐漸發(fā)育成叢生小植株。在無茵條件下，切下叢生小植株，接種到生根培養(yǎng)基(生根培養(yǎng)以Kyoto培養(yǎng)基生根效果較好)中，不久植株即可生根，待小植株長到一定大小時，即可向溫室移栽。

生根階段以較低無機鹽濃度有利于根的發(fā)生和生長,激素比例以較低分裂素和生長素為宜,同時添加一些天然提取物,如香蕉汁、椰乳等也可促進(jìn)生根。另外適宜濃度的活性炭有利于蝴蝶蘭生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基的特點？5煉苗、移栽當(dāng)試管苗具3～4片葉，生根苗長至3～5cm時可進(jìn)行煉苗,將培養(yǎng)瓶放到栽培溫室中煉苗3-4天。煉苗后，小心將苗從瓶內(nèi)取出，用清水將培養(yǎng)基及瓊脂沖洗干凈，切勿傷斷根系，再用低濃度的多菌靈或高錳酸鉀稀溶液（0.05%）浸泡5min,可以提高移栽成活率，且對污染苗移栽效果明顯。馴化煉苗期間的技術(shù)要點？時間？蝴蝶蘭組培商品瓶苗的質(zhì)量表準(zhǔn)？商品瓶苗的出瓶、包裝、運輸？免馴化移栽技術(shù)？

將苗取出分級晾干，雙葉距大于5cm的苗為特級苗，3-5cm的苗為一級苗，2-3cm的苗為二級苗。晾干后的小苗用水苔包裹根系，露出葉片和莖基，通常特級苗直接種植于7cm盆中，一級苗種植于5cm盆中，盆地需墊3-5塊塑料粒，以便透水，防止盆孔被水苔堵塞。二級苗種植于128孔的穴盤中或植于育苗盤中。小于2cm的苗可棄去或撒植于育苗盤中。3其它外植體的誘導(dǎo)培養(yǎng)

3.1莖尖培養(yǎng)

3.2葉片培養(yǎng)

3.3原球莖繼代3.1莖尖培養(yǎng)莖尖的切取

通常采用5—6片葉片的幼苗莖尖效果較好。先將葉片的大部分切掉，除去葉的莖在流水下沖洗干凈，在超凈工作臺上用10％次氯酸鈉溶液作表面滅菌15min，除去葉原基后，再用5％次氯酸鈉溶液滅菌l0min，然后用無菌水沖洗干凈，無菌條件下切取莖尖及葉基部的腋芽，大小2—3mm，然后接種于事先備好的培養(yǎng)基上。

培養(yǎng)基莖尖培養(yǎng)采用vw培養(yǎng)基進(jìn)行液體培養(yǎng)或固體培養(yǎng)，固體培養(yǎng)時添加瓊脂9g、蔗糖20g、15％的椰乳，pH值5.4。培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度以25℃為宜，光照度2000lx，光照16-24h／d。液體培養(yǎng)時，可控床以160r／min的速度作振蕩培養(yǎng)，7-10d轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基，約1個月的時間即誘導(dǎo)出原球莖，此時再轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。莖尖培養(yǎng)技術(shù)流程選5-6片葉的幼苗剪掉葉片流水沖洗干凈10%次氯酸鈉15min除去葉原基5%次氯酸鈉10min無菌水沖洗干凈剪取2-3mm莖尖接種VW培養(yǎng)基溫度25℃,光照度20001x，光照16-24h／d培養(yǎng)3.2葉片培養(yǎng)取材部位

葉片培養(yǎng)時，一般取材于花梗腋芽培養(yǎng)成的小植株或蝴蝶蘭試管實生苗。采用花梗腋芽培養(yǎng)成的小植株葉片時，可將其葉片切成0.5cm大小進(jìn)行接種，試管實生苗以100-120d的幼苗為宜，將整葉切下直接插入培養(yǎng)基中，以第一個葉片(頂部)原球莖形成效果最好。以上兩種方法的優(yōu)點是，接種前避免了消毒這一關(guān)。在成年植株上切取葉片時，以切取葉片的基部0.5-1.0，上表面朝上平放為宜，其原球莖形成的比率較高。

培養(yǎng)基葉片培養(yǎng)時，選用的基本培養(yǎng)基為Kyoto改良培養(yǎng)基，附加KTl0．0mg/L、NAA5.0mg／L及10％蘋果汁或椰乳，也有人用Kyoto培養(yǎng)基附加BAl0.0mg／L、NAA10.0mg/L及10．0mg/L腺嘌呤，也可用MS培養(yǎng)基或VW培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中蔗糖30g/L，瓊脂9g／L，pH值調(diào)整為5.4。培養(yǎng)條件溫度為25，光照廢500lx，光照16h／d。葉片培養(yǎng)的技術(shù)流程花梗腋芽培育的小植株100-120d無菌實生苗成年植株取葉片基部消毒接種整葉切下接種葉片剪成0.5cm接種溫度25℃,光照度5001x，光照16h／d培養(yǎng)3.3原球莖繼代當(dāng)采用莖尖、葉片或根尖等外植體培養(yǎng)誘導(dǎo)出的原球莖達(dá)到一定大小并長滿瓶時，需及時繼代增殖，即在無茵條件下切成小塊，接種到新鮮的培養(yǎng)基中，切塊大小應(yīng)在2mm以上，繼代培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加5—10mg/L的BA、1mg/L的NAA，培養(yǎng)基中添加10％椰乳，增殖效果更好，但品種間差異很大。討論：如何選擇蝴蝶蘭外植體？蝴蝶蘭進(jìn)行組織培養(yǎng)快速繁殖常用的外植體主要有莖尖、莖段、葉片、根尖、根段、花梗腋芽、花梗節(jié)間切段、幼胚、種子等。各個外植體培養(yǎng)成功的難易程度不同，誘導(dǎo)率不同，適于的誘導(dǎo)培養(yǎng)的途徑不同。莖尖是較容易誘導(dǎo)培養(yǎng)、成功率較高的部位,它是最早用于蘭花快速繁殖的外植體。

葉片作為外植體既可減少對母株的傷害,且取材不受季節(jié)限制。幼葉比成熟葉片誘導(dǎo)率高,且以整片直接插入培養(yǎng)基中較好;成熟葉片則葉基部誘導(dǎo)率較高。但總體而言，利用葉片誘導(dǎo)原球莖的誘導(dǎo)率還比較低。另外，利用根尖、根段作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，同樣對母株基本上不會有太大的影響,而且可以保持母株的優(yōu)良性狀,同時也不會受取材時間的限制,可隨時進(jìn)行研究,但是誘導(dǎo)率比較低，增殖系數(shù)還不是很理想,并且繁殖周期一般比較長。利用花梗及花梗芽作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)就是代替蝴蝶蘭莖尖培養(yǎng)的一種方法，是目前進(jìn)行蝴蝶蘭組培快繁最常選用的外植體。蝴蝶蘭不同外植體的成活率有較大差異，其中花梗側(cè)芽的成活率最高，達(dá)75%，其次為花梗，成活率為