關于植物總的提取與電泳第1頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月1.實驗目的和要求掌握RNA制備以及常用鑒定方法的原理、操作步驟、注意事項和技術關鍵。第2頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月2.相關基礎知識由于RNA是基因表達過程中非常重要的生物分子，如mRNA,它攜帶了DNA的全部編碼信息。RNA的分離是研究基因功能的重要基礎之一，在分子生物學中占有重要的地位。提取的mRNA可用于Northernblot、RT-PCR、構(gòu)建cDNA文庫、GeneChips以及體外翻譯等實驗。第3頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月由于RNase極穩(wěn)定，所以，在操作RNA時，要格外仔細，以防RNA被降解。在提取RNA之前，必須對所用器皿進行RNase滅活處理。如用180oC干烤8小時以上處理玻璃器皿，或用0.1的焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃器皿和其它用品。所用水以及相關的緩沖液也需要用0.1DEPC水處理，但Tris-Cl緩沖液等不可以用DEPC處理。注意：DEPC有致癌之嫌，必須小心操作，防止接觸與吸入！第4頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月植物細胞內(nèi)的RNA主要是rRNA（占80～85％）、tRNA及小分子RNA（占10～15％）和mRNA（占1～5％）。rRNA含量最豐富，由25S、18S和5S幾類組成。mRNA種類繁多，分子量從數(shù)百至數(shù)千堿基不等，但絕大多數(shù)mRNA在3’端都有一個polyA尾巴，因此，可根據(jù)此特性用寡聚脫氧胸苷(OligodT)層析柱從總RNA中將mRNA分離出來。一般情況下，提取的總RNA也可用于Northernblot試驗。第5頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月第6頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月提取植物RNA時，要注意的問題：1）一般用機械研磨的方法破碎植物組織細胞；2）要加入蛋白質(zhì)變性劑，使核蛋白與RNA分離并釋放出RNA；3）抑制內(nèi)源和外源RNase活性；4）將RNA與DNA、蛋白質(zhì)及其它細胞成分分開。第7頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月苯酚法：用SDS變性蛋白并抑制RNase活性，經(jīng)多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA；胍鹽法：用異硫氰酸胍或鹽酸胍和-巰基乙醇變性蛋白，并抑制RNase的活性，經(jīng)酚氯仿抽提后再沉淀；氯化鋰沉淀法：因為鋰在在一定pH下能使RNA相對特異地沉淀，但容易使小分子RNA損失，而且殘留的鋰離子對mRNA有抑制作用。已有多種較為成熟的分離總RNA的方法，常用的有3種:第8頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月本實驗采用QIAGEN試劑盒，其原理是依據(jù)胍鹽法。即在含有強的異硫氰酸胍變性劑的提取液中裂解植物組織粉末，在提取緩沖液中含有RNase抑制劑，抑制RNase活性，保證RNA的完整性。通過第一次離心柱時細胞碎片被阻留在柱子上，溶液均質(zhì)化，包括RNA在內(nèi)的分子物質(zhì)通過離心柱。加入乙醇后，再過第二個離心柱，RNA就結(jié)合在柱子底部有硅膠的膜上，洗去其它雜質(zhì)，最后用無RNase的水溶出RNA。該柱子可結(jié)合100g大于200bp的RNA，所以應控制起始材料的用量。第9頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA的檢測：RNA的檢測主要用瓊脂糖凝膠電泳，分為非變性電泳和變性電泳。一般變性電泳用的最多是甲醛變性電泳（如Northernblot實驗過程中）。第10頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月由于RNA分子是單鏈核酸分子，它不同于DNA的雙鏈分子結(jié)構(gòu)，其自身可以回折形成發(fā)卡式二級結(jié)構(gòu)及更復雜的分子狀態(tài)，以至通過一般傳統(tǒng)的瓊脂塘凝膠電泳難以得到依賴于分子量的電泳分離條帶，為此電泳上樣前將樣品于65攝氏度加熱變性5分鐘，使RNA分子的二級結(jié)構(gòu)充分打開，并且在瓊脂糖凝膠中加入適量的甲醛，可保證RNA分子在電泳過程中持續(xù)保持單鏈狀態(tài)，因此，總RAN樣品便在統(tǒng)一構(gòu)像下得到了瓊脂糖凝膠上的依賴于分子量的逐級分離條帶。第11頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月而且RNA變性后有利于在轉(zhuǎn)印過程中與硝酸纖維素膜的結(jié)合。RNA通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，可以直觀快捷的分析RNA質(zhì)量之優(yōu)劣，當有標準的“分子標尺”（marker）存在時，還可相對客觀的對總RNA樣品進行定性和定量。為測定片段大小，可在同一塊膠上加標記物一同電泳，之后將標記物膠切下，上色、照像。第12頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月3.實驗材料與試劑材料：新鮮植物組織（水稻）試劑：QiagenRNeasy植物試劑盒，甲醛，瓊脂糖電泳系統(tǒng)，凝膠成象系統(tǒng)等。第13頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月4.實驗方法和步驟第14頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月第15頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗步驟（每一步均要求無RNase污染）①稱取新鮮材料100mg，液氮速凍；②在預冷的研缽中并在液氮中將材料研磨成細粉末，轉(zhuǎn)移到2ml或1.5ml

離心管中；③待液氮揮發(fā)（但不能解凍）后，加入

450μl提取緩沖液RLT，混勻后在

56℃下溫育1～3min；第16頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月④將裂解液加到離心柱（淡紫色）上下接一個2ml收集管，最大轉(zhuǎn)速離心

2min。裂解液通過柱子時被均質(zhì)化小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移到另一新離心管；加入0.5倍體積（225μl）96～100%

乙醇，混合均勻。加入乙醇后，可能會出現(xiàn)沉淀，無影響；第17頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月將混合液全部（包括沉淀675μl）轉(zhuǎn)移到吸附離心柱（粉紅色）內(nèi)，下接2ml的收集管，10000rpm離心15秒。棄去管內(nèi)液體；⑦加入700μlRW1緩沖液，10000rpm轉(zhuǎn)速下離心25秒，棄去收集管；⑧將離心柱轉(zhuǎn)移到一個新的2ml收集管上，加入500μlRPE緩沖液，10000rpm離心15秒，棄去管內(nèi)液體重復使用收集管；第18頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月加入500μlRPE到離心柱內(nèi)，最大轉(zhuǎn)速離心2min，干燥離心柱，棄去收集管；⑩把離心柱接在一個新的1.5mlEppen管上，加入30～50μl無RNase水（0.1%DEPC處理），10000rpm離心1min，洗出RNA。若RNA產(chǎn)量在20μg以上，用30～50μl無RNase水再洗脫1次。RNA樣品保存于-20℃?zhèn)溆?。?9頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月瓊脂糖凝膠非變性電泳

所需試劑：

10ⅹ凝膠緩沖液嗎啉代丙磺酸（MOPS）（pH7.0）200mmol/LNaAC50mmol/LEDTA（pH8.0）10mmol/L

用DEPC水配制，用NaOH調(diào)節(jié)pH＝7.0。過濾除菌后避光保存。

10ⅹ電泳上樣緩沖液

50％（V/V）甘油（用DEPC處理的水稀釋）

10mmol/LEDTA（pH8.0）

0.25％（m/V）溴酚藍

0.25％（m/V）二甲苯青FF第20頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠制備（1.2％）：用1ⅹ凝膠緩沖液配制1.2％的凝膠，至少使其凝固30分鐘后進行上樣；樣品制備：在離心管中，將RNA樣品與10ⅹ上樣緩沖液以9:1比例混勻，迅速在冰上冷浴5分鐘，瞬時離心數(shù)秒。RNA上樣量為2-30g，本次實驗為10g；上樣前凝膠須預電泳5min，隨后將樣品加入加樣孔，以5V/cm的電壓電泳1h～1.5h；待溴酚藍遷移至凝膠長度的4/5處結(jié)束電泳。將凝膠置于溴化乙錠溶液中染色約30min；在紫外燈下觀察結(jié)果(如果用于Northernblot,在凝膠轉(zhuǎn)膜前應做好移動距離的標記)。步驟：第21頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月瓊脂糖凝膠甲醛變性電泳步驟：制備凝膠(1.2％)：稱1.2克瓊脂糖，加72mlDEPC處理的水，加熱溶化。冷卻至60oC，在通風廚內(nèi)加入10×凝膠緩沖液10ml，甲醛（37％）18ml，混均后到入凝膠模具中。樣品制備：在離心管里，將RNA樣品與10×樣品緩沖液以9：1比例混合。65oC溫浴5－10分鐘，迅速在冰上冷浴5分鐘，瞬時離心數(shù)秒。對于Northern雜交實驗，總RNA上樣量可達到10-30g。第22頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2