§3.9RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)背景:以前人們認(rèn)為，絕大部分的RNA分子要么是蛋白質(zhì)基因表達(dá)的信使分子(mRNA)，要么是協(xié)助完成基因表達(dá)的結(jié)構(gòu)分子(tRNA和rRNA)。但是，近幾年來，人們發(fā)現(xiàn)了很多新的RNA分子，它們雖然也從基因組DNA中轉(zhuǎn)錄而來，它們不是tRNA和rRNA以及其他已知的RNA(如snRNA)，又不表達(dá)為蛋白質(zhì)，因此也不是mRNA。不管是原核生物還是真核生物，都存在這類RNA分子，原核的情況下稱為smallRNA(sRNA)，真核的情況下通常稱為noncodingRNA(ncRNA)。目前一頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)人們發(fā)現(xiàn)，這一類RNA分子起著非常重要的生物學(xué)功能，如影響發(fā)育過程、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、影響染色體復(fù)制、對(duì)RNA進(jìn)行加工和修飾、影響mRNA的穩(wěn)定性進(jìn)而影響翻譯、甚至影響蛋白質(zhì)的降解和轉(zhuǎn)運(yùn)，……，等等。這一類RNA分子一般通過兩種機(jī)制發(fā)揮功能：1.和目標(biāo)分子形成堿基配對(duì),如RNAi;2.形成空間結(jié)構(gòu),如核酶(ribozyme)?，F(xiàn)在，越來越多的科學(xué)家開展了對(duì)這類RNA的研究，《SCIENCE》雜志連續(xù)幾年將之評(píng)為十大熱門研究領(lǐng)域之一。在這種形勢(shì)下，對(duì)RNA結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)就顯得格外重要。目前二頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)一條單鏈RNA可以折疊成非常多可能的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這種可能的數(shù)目隨著序列的長(zhǎng)度呈指數(shù)增長(zhǎng)。一條200個(gè)堿基的RNA，就有1050種可能的結(jié)構(gòu)，而一般說來，正確的只有一種。必須有一種評(píng)價(jià)函數(shù)(指標(biāo))，使得正確結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的值最大(或最小)。目前三頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)§3.9.1

RNA結(jié)構(gòu)的特征和術(shù)語(yǔ)因?yàn)镽NA是單鏈分子，在實(shí)際的生物體環(huán)境中它會(huì)折疊起來，形成很多的莖(stem)和環(huán)(loop)。絕大部分的莖環(huán)結(jié)構(gòu)互相之間是“嵌套”關(guān)系(nested),即對(duì)于任意兩對(duì)堿基對(duì)(i,j)和(m,n)，要么i<m<n<j，要么m<i<j<n。目前四頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)§3.9.2堿基對(duì)數(shù)目最大化(Nussinov)方法文獻(xiàn):SIAMJournalofAppliedMathematics35:68-82,1978該方法認(rèn)為，那種具有最大數(shù)目的堿基對(duì)的結(jié)構(gòu)就是正確的結(jié)構(gòu)。計(jì)算時(shí)采用動(dòng)態(tài)規(guī)劃的思想，是一種遞歸的過程：先定出一小段序列的最好二級(jí)結(jié)構(gòu)，再用相同的法則將序列擴(kuò)展，找到相應(yīng)的最好二級(jí)結(jié)構(gòu)；這種方法不斷進(jìn)行，直到全長(zhǎng)序列。目前五頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)KeyIdea:要在更短序列的最好二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上獲得序列i到j(luò)的最好二級(jí)結(jié)構(gòu)，只有4種可能的途經(jīng)：原有結(jié)構(gòu)兩端各延伸一個(gè)殘基并將它們配對(duì)；向5’端延伸一個(gè)不配對(duì)的殘基;向3’端延伸一個(gè)不配對(duì)的殘基;將已存在最好二級(jí)結(jié)構(gòu)的兩段合并起來;目前六頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)具體算法：將一段長(zhǎng)度為L(zhǎng)的RNA序列記為b1,b2,……,bi,……,bj,……bL并定義并記從bi到bj所構(gòu)成的子序列所能形成的最大堿基對(duì)數(shù)目為(i,j)。目前七頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)第一步：初始化Let(i,i-1)=0,fori=2toL;(i,i)=0,fori=1toL;第二步：遞歸計(jì)算從所有的長(zhǎng)度為2的子序列開始，一直到長(zhǎng)度為L(zhǎng)，按以下公式計(jì)算(i,j)：目前八頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)以序列GGGAAAUCC為例子：初始化(i,i-1)=0,fori=2toL;(i,i)=0,fori=1toL;b.開始遞歸計(jì)算目前九頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)C.繼續(xù)遞歸過程d.完成遞歸計(jì)算（1，L）的值就是該序列所能形成堿基對(duì)的最大數(shù)目。從（1，L）開始，通過回溯過程，就可得到相應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。目前十頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)回溯算法從右上角（1，L）開始，放進(jìn)堆棧。遞歸：反復(fù)運(yùn)用以下規(guī)則,直到堆棧為空：取出堆棧上層位置，假設(shè)為(i,j)，如果i>=j,繼續(xù)取堆棧；如果(i+1,j)=(i,j)，放(i+1,j)入堆棧；如果(i,j-1)=(i,j)，放(i,j-1)入堆棧；

如果(i+1,j-1)+(i,j)=(i,j)記錄(i,j)堿基對(duì)，放(i+1,j-1)入堆棧；{前三種情況不止一種成立時(shí)，須綜合考慮}否則fork=i+1toj-1:{if(i,k)+(k+1,j)=(i,j)放(k+1,j)和(i,k)入堆棧并跳出循環(huán)；}目前十一頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)選取不同的回溯路徑得到不同的結(jié)構(gòu)目前十二頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)注意：回溯的線路經(jīng)常不是唯一的，所以結(jié)構(gòu)也是不唯一的，其中有些顯然是不可能的。另外，這種方法無(wú)法考慮“假結(jié)”(pseudoknot)的情況。這種算法可以加以推廣，比如讓GC配對(duì)得3分，而AU配對(duì)得2分，這時(shí)候只需對(duì)(i,j)函數(shù)重新定義即可。目前十三頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)§3.9.3自由能最小化(Zuker)方法簡(jiǎn)介

文獻(xiàn)：NucleicAcidsResearch9:133-148,1981

MethodsinEnzymology180:262-288,1989實(shí)際上，RNA折疊的真正動(dòng)力是鏈內(nèi)“相互作用”的而不是“數(shù)堿基對(duì)”。Zuker方法是一種自由能最小化方法，它假設(shè)正確的結(jié)構(gòu)應(yīng)具有最低的自由能(G)。Zuker方法中G被近似為來自loops,basepairs及其他二級(jí)結(jié)構(gòu)元素的貢獻(xiàn)之和。對(duì)于一個(gè)stem，其貢獻(xiàn)計(jì)算為堿基對(duì)的“堆積能”而不是簡(jiǎn)單的各堿基對(duì)貢獻(xiàn)之和。例如，一個(gè)有n個(gè)堿基對(duì)的stem,其貢獻(xiàn)是n-1個(gè)堆積能之和。目前十四頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)詳細(xì)規(guī)則參考：PNAS83：9373-9377，1986有了這些規(guī)則，運(yùn)用類似于前面Nussinov方法中的動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法(當(dāng)然實(shí)際要復(fù)雜很多，但思想一樣)，就可獲得可能為自由能最小化的二級(jí)結(jié)構(gòu)。目前十五頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)§3.9.4多序列alignment法的基本思路一個(gè)生物分子，如果它主要依靠其結(jié)構(gòu)發(fā)揮功能，則一般地其結(jié)構(gòu)的保守性要高于其序列的保守性；對(duì)于結(jié)構(gòu)RNA中的stem，為了保證其結(jié)構(gòu)不被破壞，就有了堿基“協(xié)同突變”的特點(diǎn)：根據(jù)這個(gè)特點(diǎn)，我們能很有把握地推測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)。目前十六頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)顯然，位點(diǎn)對(duì)(2,9)提供了比其它位點(diǎn)對(duì)更多更可靠的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息。信息論中一種稱為mutualinformation的指標(biāo)恰好能定量計(jì)算這種信息，公式為：Mij的意義是：i,j兩列的實(shí)際變化偏離“各自獨(dú)立變化”的程度。目前十七頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)例1：i…jU…AU…AU…AU…AMij=0例2：i…jU…AC…GA…UG…CMij=2例3i…jU…AU…AG…CG…CMij=1例4：i…jU…CU…AG…CG…AMij=0思考，如何將其和具體的生物學(xué)意義聯(lián)系起來？目前十八頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)基于一千多個(gè)tRNA的多序列alignment,可以畫出右圖上部的mutualinformation圖。對(duì)照酵母tRNA-Phe的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)(右圖下部)，可以發(fā)現(xiàn)，上圖中的4簇尖峰和下圖中的4個(gè)臂完全吻合，甚至因在三級(jí)結(jié)構(gòu)上靠近而產(chǎn)生的相關(guān)(虛線)也有所體現(xiàn)。到目前為止，這種基于多序列alignment的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法是公認(rèn)的最成功方法，但是需要很多條件。目前十九頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)§3.9.5網(wǎng)上RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件Mfold

server,網(wǎng)址：/applications/mfold/cgi-bin/rna-form1.cgiViennaRNAPackage，網(wǎng)址：http://www.tbi.univie.ac.at/~ivo/RNA/其中的程序RNAfold用的就是自由能最小化(Zuker)方法；GeneBee

服務(wù)器,網(wǎng)址：http://www.genebee.msu.su/services/rna2_reduced.html......目前二十頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)利用GeneBee服務(wù)器的一個(gè)示例目前二十一頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)稍等幾分鐘,即可看到結(jié)果:

目前二十二頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)目前二十三頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)目前二十四頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)目前二十五頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)目前二十六頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)注意:同一個(gè)序列用不同的預(yù)測(cè)程序可能得到不同的結(jié)果；如果一條較短序列是一條較長(zhǎng)序列的子序列，即使用同一個(gè)程序預(yù)測(cè)，短序列的結(jié)構(gòu)可能和長(zhǎng)序列的相應(yīng)部分的結(jié)構(gòu)不同；同一個(gè)序列同一個(gè)程序，但條件參數(shù)不同，也會(huì)得到不同的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)。目前二十七頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)§3.10

找基因§3.10.1

在基因組DNA序列中尋找編碼區(qū)基于編碼區(qū)特征的方法基于數(shù)據(jù)庫(kù)的方法注意兩類假基因(pseudogenes)§3.10.2

基因的電腦克隆§3.10.3幾個(gè)常用軟件服務(wù)器目前二十八頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)目前二十九頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)CTCGGGCCGTCTCTTGGGCTTGATCGGCCTTCTTGCGCATCTCACGCGCTCCTGCGGCGGCCTGTAGGGC

AGGCTCATACCCCTGCCGAACCGCTTTTGTCAGCCGGTCGGCCACGGCTTCCGGCGTCTCAACGCGCTTT

GAGATTCCCAGCTTTTCGGCCAATCCCTGCGGTGCATAGGCGCGTGGCTCGACCGCTTGCGGGCTGATGG

TGACGTGGCCCACTGGTGGCCGCTCCAGGGCCTCGTAGAACGCCTGAATGCGCGTGTGACGTGCCTTGCT

GCCCTCGATGCCCCGTTGCAGCCCTAGATCGGCCACAGCGGCCGCAAACGTGGTCTGGTCGCGGGTCATC

TGCGCTTTGTTGCCGATGAACTCCTTGGCCGACAGCCTGCCGTCCTGCGTCAGCGGCACCACGAACGCGG

TCATGTGCGGGCTGGTTTCGTCACGGTGGATGCTGGCCGTCACGATGCGATCCGCCCCGTACTTGTCCGC

CAGCCACTTGTGCGCCTTCTCGAAGAACGCCGCCTGCTGTTCTTGGCTGGCCGACTTCCACCATTCCGGG

CTGGCCGTCATGACGTACTCGACCGCCAACACAGCGTCCTTGCGCCGCTTCTCTGGCAGCAACTCGCGCA

GTCGGCCCATCGCTTCATCGGTGCTGCTGGCCGCCCAGTGCTCGTTCTCTGGCGTCCTGCTGGCGTCAGC

GTTGGGCGTCTCGCGCTCGCGGTAGGCGTGCTTGAGACTGGCCGCCACGTTGCCCATTTTCGCCAGCTTC

TTGCATCGCATGATCGCGTATGCCGCCATGCCTGCCCCTCCCTTTTGGTGTCCAACCGGCTCGACGGGGG

CAGCGCAAGGCGGTGCCTCCGGCGGGCCACTCAATGCTTGAGTATACTCACTAGACTTTGCTTCGCAAAG

TCGTGACCGCCTACGGCGGCTGCGGCGCCCTACGGGCTTGCTCTCCGGGCTTCGCCCTGCGCGGTCGCTG

CGCTCCCTTGCCAGCCCGTGGATATGTGGACGATGGCCGCGAGCGGCCACCGGCTGGCTCGCTTCGCTCG

GCCCGTGGACAACCCTGCTGGACAAGCTGATGGACAGGCTGCGCCTGCCCACGAGCTTGACCACAGGGAT

TGCCCACCGGCTACCCAGCCTTCGACCACATACCCACCGGCTCCAACTGCGCGGCCTGCGGCCTTGCCCC

ATCAATTTTTTTAATTTTCTCTGGGGAAAAGCCTCCGGCCTGCGGCCTGCGCGCTTCGCTTGCCGGTTGG

ACACCAAGTGGAAGGCGGGTCAAGGCTCGCGCAGCGACCGCGCAGCGGCTTGGCCTTGACGCGCCTGGAA

CGACCCAAGCCTATGCGAGTGGGGGCAGTCGAAGGCGAAGCCCGCCCGCCTGCCCCCCGAGCCTCACGGC???????目前三十頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)§3.10.1

在基因組DNA序列中尋找編碼區(qū)

基于編碼區(qū)特征的方法優(yōu)點(diǎn)：不必依賴于數(shù)據(jù)庫(kù)(不必學(xué)習(xí)和訓(xùn)練)，普適性強(qiáng)。缺點(diǎn)：準(zhǔn)確度低，特別是對(duì)于真核基因，由于其高度復(fù)雜性，預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率更低。目前三十一頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)1.尋找長(zhǎng)ORF該方法較適用于原核生物，例如，我們從某種細(xì)菌中測(cè)得以下序列：

>MYSEQ1310bp

ggcgtcgccgccgatggcgcttaggcgtagcatggggtggccggggctacggccgctgct

gctggcgggactggctaatctgctgctacccgggtctgcggccgcaggcctgaagctcat

gggcgccccagttaagatgaccgtgtctcaggggcagtcagtgaagctcaactgcagcgt

ggaggggatggaggaccctgacatccactggatgaaggatggcaccgtggtccagaatgc

aagtcaggtgtccatctccatcagcgagcacagctggattggcttactcagccttaagtc

agtggagcgg我們可以將它按六種讀框?qū)⑺残蟹g成蛋白序列：目前三十二頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)

RF-3TAASPA*AYCPTAPAVAAA

RF-2ADGGIASLRLMPHGPSRGSS

RF-1RRRRHRKPTAHPPRP*PRQQ

3'complccgcagcggcggctaccgcgaatccgcatcgtaccccaccggccccgatgccggcgacga5'

5'1ggcgtcgccgccgatggcgcttaggcgtagcatggggtggccggggctacggccgctgct3'

RF1GVAADGA*A*HGVAGATAAA

RF2ASPPMALRRSMGWPGLRPLL

RF3RRRRWRLGVAWGGRGYGRC

RF-3APPVP*DAAVRTQPRLGSA*

RF-2SAPSALRSSGPDAAAPRFSM

RF-1QRSQSIQQ*GPRRGCAQLEH

3'complcgaccgccctgaccgattagacgacgatgggcccagacgccggcgtccggacttcgagta5'

5'61gctggcgggactggctaatctgctgctacccgggtctgcggccgcaggcctgaagctcat3'

RF1AGGTG*SAATRVCGRRPEAH

RF2LAGLANLLLPGSAAAGLKLM

RF3CWRDWLICCYPGLRPQA*SS

目前三十三頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)

RF-3PRGL*SSRTEPATLSA*SCR

RF-2PAGTLIVTD*PCDTFSLQLT

RF-1AGWNLHGHRLPL*HLEVAAH

3'complcccgcggggtcaattctactggcacagagtccccgtcagtcacttcgagttgacgtcgca5'

5'121gggcgccccagttaagatgaccgtgtctcaggggcagtcagtgaagctcaactgcagcgt3'

RF1GRPS*DDRVSGAVSEAQLQR

RF2GAPVKMTVSQGQSVKLNCSV

RF3WAPQLR*PCLRGSQ*SSTAA

RF-3PPSPPGQCGSSSPHCRPGSH

RF-2SPISSGSMWQIFSPVTTWFA

RF-1LPHLVRVDVPHLIAGHDLIC

3'complcctcccctacctcctgggactgtaggtgacctacttcctaccgtggcaccaggtcttacg5'

5'181ggaggggatggaggaccctgacatccactggatgaaggatggcaccgtggtccagaatgc3'

RF1GGDGGP*HPLDEGWHRGPEC

RF2EGMEDPDIHWMKDGTVVQNA

RF3WRGWRTLTSTG*RMAPWSRM

目前三十四頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)

RF-3LDPTWRW*RACSSQSV*G*T

RF-2L*TDMEMLSCLQIPKSLRLD

RF-1TLHGDGDALVAPNA*EAKL*

3'complttcagtccacaggtagaggtagtcgctcgtgtcgacctaaccgaatgagtcggaattcag5'

5'241aagtcaggtgtccatctccatcagcgagcacagctggattggcttactcagccttaagtc3'

RF1KSGVHLHQRAQLDWLTQP*V

RF2SQVSISISEHSWIGLLSLKS

RF3QVRCPSPSASTAGLAYSALS

RF-3LPA

RF-2TSR

RF-1HLP

3'compltcacctcgcc5'

5'301agtggagcgg3'

RF1SGA

RF2VER

RF3QWS

目前三十五頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)我們可以直觀地看出，讀框2沒有碰到終止密碼子，所以這段序列可能是蛋白質(zhì)基因。如果能在被預(yù)測(cè)為基因的上游的合適位置上找到轉(zhuǎn)錄promoter中的保守序列：

-10位置的“TATAAT”(T80A95T45A60A50T96)-35位置的“TTGACA”(T82T84G78A65C54A45)就可增加基因預(yù)測(cè)的可信度。目前三十六頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)2.利用周期特性找編碼區(qū)原則上說，任何能研究序列周期特性的方法和軟件都可以用來探測(cè)編碼區(qū)，如D值得方法(以前講過)，各種頻譜分析方法等等。3.利用其他特征找編碼區(qū)編碼區(qū)除了有大的開讀框架和周期3特性外，還有其它一些特征，如序列復(fù)雜度和分維度(后面講)較高，GC含量高等等，這些都可以被用來尋找或幫助尋找編碼區(qū)。目前三十七頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)基于數(shù)據(jù)庫(kù)的方法1.同源性比較法2.經(jīng)驗(yàn)規(guī)律符合法3.通過和EST序列的比較來定位基因目前三十八頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)1.同源性比較法將新測(cè)得的序列直接和數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知基因序列或蛋白質(zhì)序列作同源性比較(BLAST和FASTA);若序列相似性在35%以上、期望值E在0.01以下，就基本上可以確定是基因序列;若相似性特別高，又屬于同一物種，則很可能不是新的基因。優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確性高，且可預(yù)測(cè)其編碼蛋白質(zhì)的功能。缺點(diǎn)：很多新的基因在數(shù)據(jù)庫(kù)中還找不到同源序列，因而無(wú)法用這種方法檢測(cè)到。目前三十九頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)2.經(jīng)驗(yàn)規(guī)律符合法即通過對(duì)已知基因的序列特征進(jìn)行訓(xùn)練學(xué)習(xí)、總結(jié)出規(guī)律，再用這個(gè)規(guī)律來檢驗(yàn)新測(cè)得的序列，以判斷其是否為基因序列，如前面講過的密碼子使用頻率方法。另外，馬爾科夫鏈方法(后面講)以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(用來預(yù)測(cè)編碼區(qū)時(shí))也屬于這類方法。優(yōu)點(diǎn)：是目前尋找新基因的最常用、最有效的方法，準(zhǔn)確度也高。缺點(diǎn)：若已有數(shù)據(jù)不足或數(shù)據(jù)集選取不當(dāng)，會(huì)影響預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。另外，對(duì)不同的物種常有不同的規(guī)律，需要對(duì)不同數(shù)據(jù)集體進(jìn)行學(xué)習(xí)和總結(jié)，比較麻煩。目前四十頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)3.通過和EST的比較來定位基因EST是ExpressedSequenceTag的縮寫，實(shí)際上是一些cDNA序列的片段，長(zhǎng)度一般為400到500bp。但是，實(shí)驗(yàn)中測(cè)到的EST序列來源于哪個(gè)基因，是基因的哪一部分是隨機(jī)的，無(wú)法事先確定。利用EST序列和基因組序列的比較來確定基因在基因組中的位置，甚至進(jìn)一步確定基因的精細(xì)結(jié)構(gòu)(exon,intron,splicingsites)原則上是可能的。目前四十一頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)mRNA的可變剪接EXON1INTRON1EXON2INTRON2EXON3INTRON3EXON4Pre-mRNA正常剪接EXON1EXON2EXON3EXON4成熟mRNA1可變剪接EXON1EXON3EXON4成熟mRNA2可變剪接EXON1EXON2EXON4成熟mRNA3目前四十二頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：可以確定基因的精細(xì)結(jié)構(gòu)并將其在基因組上定位，這是其他方法難以做到的?，F(xiàn)在對(duì)人類基因組中基因的標(biāo)注，很多都采用這個(gè)辦法。缺點(diǎn)：EST數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)含有大量的錯(cuò)誤，給方法的實(shí)施帶來很大的困難。另外，由于基因組DNA和EST序列的數(shù)據(jù)量都十分龐大，導(dǎo)致計(jì)算量也十分龐大。目前四十三頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)注意兩類假基因(pseudogenes)第一類假基因:基因的復(fù)制(duplication)會(huì)產(chǎn)生相同的基因一前一后緊鄰出現(xiàn)的情況。當(dāng)其中一個(gè)積累了太多的有害突變而失去功能時(shí)，就成了假基因。由于還有另一個(gè)基因發(fā)揮正常功能，所以物種仍可存活。第二類假基因:稱為“processedpseudogenes”。這類基因也源自正?；?，但沒有內(nèi)含子，其上游也沒有promoter。推測(cè)這類假基因的產(chǎn)生過程是：正?；蚪?jīng)轉(zhuǎn)錄剪接得到成熟mRNA，隨后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再經(jīng)轉(zhuǎn)座作用插入染色體的某個(gè)位置。目前四十四頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)§3.10.2

基因的電腦克隆EST是對(duì)應(yīng)于表達(dá)基因的cDNA的一些隨機(jī)片段，長(zhǎng)度一般在400到500bp之間。這些片段相互之間可能有重疊的部分?，F(xiàn)在公共EST數(shù)據(jù)庫(kù)(如NCBI的dbEST)中人類EST序列總長(zhǎng)估計(jì)已是人類基因外顯子總長(zhǎng)的十幾倍，所以這種重疊是顯而易見的。因此，通過對(duì)EST序列的比對(duì)拼接，得到全長(zhǎng)cDNA序列是完全可能的；進(jìn)一步，可以對(duì)拼接所得的全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行分析，找出可能的新基因。這樣的過程就稱為基因的電腦克隆。目前四十五頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)EST序列數(shù)據(jù)庫(kù)的形成EST序列數(shù)據(jù)庫(kù)目前四十六頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)SiClone流程圖數(shù)據(jù)準(zhǔn)備，包括：序列純化及格式標(biāo)準(zhǔn)化－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－取出一條種子庫(kù)大庫(kù)種子和大庫(kù)的序列比對(duì)判斷種子序列能否被延長(zhǎng)能—

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———延長(zhǎng)了的序列代替舊序列否結(jié)束，放入contig庫(kù)目前四十七頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)目前四十八頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)目前四十九頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于十四點(diǎn)幾個(gè)技術(shù)問題判斷能否拼接的標(biāo)準(zhǔn)：1.要求的重疊區(qū)最小序列相似性2.要求的重疊區(qū)最小長(zhǎng)度3.允許的“壞接頭”最大長(zhǎng)度如何決定新的序列1.庫(kù)序列的一致性問題2.堿基“投票”目前五十頁(yè)\總數(shù)