淺論冠心丹參注射液藥效學研究【摘要】目的觀察冠心丹參注射液對健康成年SD大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用。方法SD大鼠以結扎冠脈30min再灌注90min造成心肌缺血再灌注損傷模型，通過觀察血流動力學、生物化學和組織學指標，評價大鼠缺血再灌注前冠心丹參片預處對左心室收縮壓(LVSP)、左心室發(fā)展壓(LVDP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室等容期壓力最大變化速率(±dp／dtmax)等指標的影響；通過測定再灌注90min后血中乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性和心肌組織病理學觀察，對藥物保護心肌作用進行評價。結果表明冠心丹參注射液可有效改善缺血再灌注心臟的縮舒功能；降低缺血再灌注末期血中LDH和CK活性；組織病理學檢查表明：與溶劑對照組比較，冠心丹參注射液預處理組能明顯減輕心肌組織的損傷。結論冠心丹參注射液有抗大鼠缺血再灌注引起的心肌損傷作用。

【關鍵詞】冠心丹參注射液；心肌保護；缺血再灌注

Abstract：ObjectiveToobservethecardioprotectiveeffectsofGuanxinDansheninjectiononmyocardiuminjuryinducedbyischemiareperfusioninanesthetizedadultSDrats．MethodsThemyocardialinjuryofratsinducedbyischemia-reperfusionwasproducedbytheligationofleftcoronaryarteryfor30minfollowedby90minreperfusion．TheinfluenceofGuanxinDansheninjectiononthechangesofbiochemistry，histologyandhemodynamics，suchasLVSP，LVDP，LVEDPanddp／dtmax，wereevaluated．Theserumlactatedehydrogenase(LDH)andcreatinekinase(CK)activitieswereassayedbytheendofthereperfusion．ResultsThesystolicanddiastolicfunctionswereimproved，andtheserumLDHandCKactivitieswerereducedinGuanxinDansheninjection100mg/kgivgroup．Thehistologychangesweremanifested．ThepretreatmentofGuanxinDansheninjectionalleviatedthemyocardialdamagedistinctly，comparedwithischemia-reperfusiongroup．ConclusionsTheexperimentalresultsdemonstratetheeffectsofGuanxinDansheninjectiononmyocardialinjuryinducedbyischemia-reperfusioninanesthetizedrats．

Keywords:DanshenGuanxininjection;myocardialprotection;ischemiareperfusion

1冠心丹參注射劑的優(yōu)點及提取工藝簡介

天然植物中有許多活性物質具有抗心肌缺血，缺氧作用，其中一些已開發(fā)成治療冠心病和心絞痛的新藥。冠心丹參片的主要成分為丹參，三七，降香油，具有活血化瘀，理氣止痛的作用。用于氣滯血瘀所致的胸悶，胸痹，心悸氣短；冠心病等上述證狀者。片劑口服雖然相對安全但起效慢，尤其在治療一些急癥時，凸顯出劑型的不足，所以將具有抗心肌缺血，缺氧活性的有效物質制成注射劑無疑是搶救和治療冠心病和心絞痛等突發(fā)疾病的最佳方案。

丹參1000g，10倍量水回流提取3次，每次2h，合并提取液，濃縮至g生藥/mL,用D101大孔吸附樹脂處理，先用2BV注射用水洗脫，然后用3BV80%乙醇洗脫，收集洗脫液濃縮至g生藥/mL；三七粗粉1000g，浸泡40min，用10倍量70%乙醇回流提取3次，每次2h，合并提取液濃縮成g生藥/mL，然后吸取提取液用已經(jīng)預處理好的D101大孔吸附樹脂柱處理：先用水洗至流出液不顯Molish反應，然后用3BV70%乙醇洗脫，流速為mL/min，收集洗脫液濃縮成g生藥/mL；降香飲片1000g，加水8倍量，水蒸汽蒸餾提取11h收集蒸餾液，冷藏24h，分去上層油層。

合并上述三液，加注射用水成1000mL，加入注射劑用活性炭，用量為%，加熱回流30min，減壓抽濾過孔徑為μm的微孔濾膜灌封于2mL的安瓿中采用流通蒸汽滅菌法滅菌60min即得。

2材料與方法

材料

儀器

Medlab生物信號采集處理系統(tǒng)(南京美易科技有限公司)；動物人工呼吸機(DH—1型，浙江醫(yī)科大學醫(yī)療儀器實驗廠)；心電圖機(XDH—3B型，上海醫(yī)用電子儀器廠)。

藥品與試劑

冠心丹參片(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司)，乳酸脫氫酶(LDH)測試盒及肌酸激酶(CK)測試盒(南京建成生物工程研究所)，冠心丹參注射液本實驗室自制。

動物

昆明種小鼠100只，6～8周齡，雌雄各半，體重18～22g；健康成年SD大鼠70只，300～350g，雌雄各半(由遼寧醫(yī)學院動物實驗中心提供)。

方法

肌缺血再灌注模型制備

大鼠在麻醉下(烏拉坦g·kg-1，ip)切開頸部皮膚，氣管內插管，接人工呼吸機，呼吸頻率55～65／min，潮氣量～2mL·100g-1，呼-吸時比為：1，壓力在～kPa之間。根據(jù)呼吸頻率及深度調整呼吸參數(shù)。分離左、右頸總動脈，左頸總動脈插入一含％肝素生理鹽水的PE管，另取一個充滿％肝素生理鹽水的PE管經(jīng)右頸總動脈插入左心室，根據(jù)顯示器所示壓力圖形改變判斷插管是否進人心室腔。兩導管均連壓力換能器，分別將信號輸入到Medlab生物信號采集處理系統(tǒng)，以監(jiān)測大鼠血壓和左心室血流動力學變化。觀察指標包括收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)和平均動脈壓(MBP)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室等容期壓力最大變化速率(±dp／dt)、左心室舒張壓(LVDP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室發(fā)展壓(LVDP，系LVSP與LVEDP的差值)、心率(HR)。將針式電極固定于大鼠四肢皮下，以監(jiān)測肢體Ⅱ導聯(lián)心電圖變化。沿胸骨左緣剪開3，4，5肋骨，暴露心臟，剪開心包膜。以左冠狀動脈為標志，用3／8圓3×10不銹鋼圓針，在左冠狀動脈下穿一4-0絲線。進針深度穿過心肌1mm左右，進出針問寬度在進出針間寬度在動脈周圍～2mm左右。穩(wěn)定15min，待各指標穩(wěn)定后記錄藥前心電圖及血壓等血流動力學各值。將一細小PE管墊于血管與結扎線之間，拉緊結扎線使細小乳膠管壓迫左冠狀動脈而致閉塞。以結扎后心臟局部發(fā)紺伴隨T波高聳或ST段抬高，作為結扎成功的標準。結扎30min后，松開結扎線再灌注90min，以局部發(fā)紺逐漸變?yōu)榧t潤、心電圖ST段逐漸恢復為再灌注成功的標志。在缺血期及再灌注期每隔15min記錄一次上述指標。每組8只，共4組：假手術組、溶劑對照組(IR)、冠心丹參片預處理組(GuanxinDanshentablet)，冠心丹參注射液預處理組(GuanxinDansheninjection)。假手術組不進行缺血再灌手術，灌胃等容積生理鹽水；溶劑對照組進行缺血再灌手術，灌胃等容積生理鹽水；冠心丹參片預處理組灌胃冠心丹參片的懸濁液150mg／kg，第4組為灌胃等容積生理鹽水并肌肉注射冠心丹參注射液100mg/kg，連續(xù)給藥兩周后進行手術。

血清LDH和CK活性測定

各組最后一次血流動力學指標測定后即從左頸總動脈取血約1mL，2500r/min，離心15min，得到大鼠血清，用LDH測試盒及CK測試盒分別測定。

電鏡組織學觀察

大鼠心肌缺血再灌注結束后，假手術組、溶劑對照組(IR)、冠心丹參片預處理(GuanxinDanshentablet)、冠心丹參注射劑預處理前(GuanxinDansheninjection)組各取2鼠心臟，用銳利刀片取左室結扎線下與心尖部中點左心室壁小塊心肌，體積為2mm×2mm×2mm，用4％戊二醛處理，經(jīng)脫水、包埋、超薄切片，染色后在透射電鏡下觀察。

冠心丹參注射劑對夾閉小鼠氣管心電圖消失時間的影響

取小鼠32只，雌雄各半，體重18～22g，平均體重(±)g，隨機分為4組,每組8只，第1組小鼠灌胃等容積生理鹽水，第2組灌胃給予冠心丹參片的懸濁液100mg／kg，第3組小鼠灌胃冠心丹參片的懸濁液150mg／kg，第4組為灌胃等容積生理鹽水并注射冠心丹參注射100mg/kg，每日灌胃，連續(xù)給藥兩周，末次給藥后40min，將小鼠用％戊巴比妥鈉30mg／kg腹腔注射麻醉，仰位固定于小鼠解剖臺上，四肢插入心電圖針形電極，置心電監(jiān)護儀下，觀察標Ⅱ導聯(lián)心電圖。手術剪開小鼠頸部，分離氣管，觀察從夾閉小鼠氣管至小鼠心電圖消失時間，所得數(shù)據(jù)用組間t檢驗，比較給藥組與生理鹽水對照組之間的差異。

冠心丹參注射劑對小鼠常壓耐缺氧的影響

取小鼠32只，雌雄各半，體重18～22g，平均體重g，隨機分為4組，每組8只，第一組灌胃等容積生理鹽水，第2組灌胃冠心丹參片的懸濁液150mg／kg，第3組灌胃冠心丹參片的懸濁液100mg／kg。第4組灌胃生理鹽水，注射冠心丹參注射劑100mg／kg，連續(xù)灌胃14d，末次給藥后40min，將小鼠置于內裝200mL廣口瓶內，瓶口涂抹凡士林，蓋緊瓶蓋，記錄小鼠裝入瓶內蓋緊瓶蓋至小鼠停止呼吸的時間，即為小鼠常壓耐缺氧時間，數(shù)據(jù)用組間t檢驗。

對小鼠出血時間的影響

取小鼠32只，雌雄各半，體重18～22g，平均體重g，隨機分為4組，每組8只，第一組灌胃等容積生理鹽水，第2組灌胃冠心丹參片的懸濁液150mg／kg，第3組灌胃冠心丹參片的懸濁液100mg／kg。第4組灌胃生理鹽水，注射冠心丹參注射劑100mg／kg，連續(xù)給藥7d，末次給藥12h，用毛細管法測定出血時間。

統(tǒng)計方法采用單因與方差分析及q檢驗。

3實驗結果

見表1。

表1冠心丹參注射液對大鼠缺血再灌注后左心室收縮壓(LVSP)的影響注：與溶劑對照組比較，

見表2。

表2冠心丹參注射液對大鼠缺血再灌注后左心室舒張壓(LVDP)的影響注：與溶劑對照組比較，

見表3。

表3冠心丹參注射液對大鼠缺血再灌注后左心室等容期壓力最大變化速率組別注：與溶劑對照組比較，

見表4。

表4冠心丹參注射液對大鼠缺血再灌注后左心室等容期壓力最大變化速率注：與溶劑對照組比較，

見表5。

表5冠心丹參注射液對大鼠缺血再灌注后

乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性的影響注：與溶劑對照組比較，

電鏡觀察結果假手術組心肌細胞膜完整，線粒體膜完整，嵴致密，基質顆粒均勻(圖lA)。溶劑對照組細胞水腫，部分心肌細胞膜局部破裂；線粒體分布紊亂、腫脹，外膜破損，嵴減少、排列紊亂、模糊不清、甚至斷裂消失，基質減少，線粒體內大片空化(圖1B)。冠心丹參片組心肌線粒體改變明顯輕于溶劑對照組，心肌細胞膜無破裂，肌原纖維完整有序；線粒膜完整，嵴致密，基質密度變淡，局部出現(xiàn)空化區(qū)域(圖1C)。冠心丹參注射劑組心肌細胞膜無破裂，肌原纖維完整有序；線粒體體膜完整，嵴致密，基質顆粒均勻(圖1D)，放大20000倍。A.假手術組;B.溶劑對照組;C.冠心丹參片對照組;D.冠心丹參注射液對照組

圖1電鏡觀察結果×20見表6。

表6冠心丹參注射液對小鼠出血時間的影響組別時間/s假手術組437±冠心丹參片預處理組100mg／kg533±冠心丹參片預處理組150mg／kg538±冠心丹參注射劑預處理組100mg／kg584±注：與溶劑對照組比較，

見表7。

表7冠心丹參注射液對夾閉小鼠氣管心電消失時間的影響注：與溶劑對照組比較，

見表8。

表8冠心丹參注射液對小鼠耐缺氧時間的影響注：與溶劑對照組比較，

4討論

本實驗通過麻醉開胸后冠脈結扎造成SD大鼠缺血再灌注心肌損傷模型，從血流動力學、生物化學和病理組織學上綜合評價冠心丹參注射液對大鼠心肌的保護用。結果表明，冠心丹參注射液100mg·kg-1預處理組可明顯改善大鼠心肌缺血再灌注引起的心舒縮功能