活血化瘀方藥對(duì)Poresky大鼠模型內(nèi)皮細(xì)胞的影響【摘要】：［目的］觀察活血化瘀方藥對(duì)Poresky多囊卵巢綜合征大鼠模型內(nèi)皮細(xì)胞功能及形態(tài)的影響。［方法］依照Poretsky法建立PCOS大鼠模型，隨機(jī)分為中藥組、模型組，并設(shè)立正常組作對(duì)照。測(cè)定各組血清FSH、LH、T、INS及血漿ET、PAI1的水平，電鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)變化。［結(jié)果］模型組內(nèi)皮細(xì)胞間的連接失去正常形態(tài)，基底膜不連續(xù)，細(xì)胞膜損傷、不完整；胞質(zhì)內(nèi)空泡明顯增多，線粒體膨脹，嵴溶解、斷裂、消失；細(xì)胞核聚集，異染色質(zhì)增多。中藥組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞間連接較緊密，線粒體無(wú)明顯腫脹，嵴清晰，吞飲泡和溶酶體增多，胞質(zhì)偶見(jiàn)空泡。模型組血漿PAI1、ET比正常組增高，差異有顯著性，中藥組與模型組比較，ET、PAI1降低；與正常組比較PAI1水平無(wú)顯著差異，ET增高。［結(jié)論］PCOS大鼠模型存在內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)改變，血漿ET、PAI1升高，提示PCOS存在血瘀的微觀病理基礎(chǔ)?；钛鲋兴幠軌驈男螒B(tài)學(xué)上修復(fù)PCOS大鼠損傷的內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)整內(nèi)皮細(xì)胞功能。

【關(guān)鍵詞】多囊卵巢綜合征；動(dòng)物模型；活血化瘀；內(nèi)皮細(xì)胞

Abstract：［Objective］ToobservetheeffectofChineseherbsforactivatingbloodstasisontheshapeandfunctionoftheendothelialcellsinrataorta.［Method］RatmodelsofPCOShavebeenestablishedaccordingtoPoresky,randomizedintoanimalmodelandChinesemedicinegroup(TCMgroup)，normalratswerecontrolgroup.MeasuretheserumlevelofFSH,LH,T,INSandplasmaETPAI1,andobservetheendothelialcellmorph.［Results］Inthemodelgroup,theendotheliacellsoftheaortawerecontracted,withdiscontinuousbasementmembrane,inflatedchondriosome,themiddlelayersmoothmusclestendingtomoveinsideandoutofthenormalshapeofintraendothelialjunction.IntheTCMgroup,theendothelialcellsappearedflat,arrangingalongthelongaxisofthebloodvessels,normalendothelialcellintegritywithscantycytoplasmandthemicroscopicappearanceshowshighlydevelopedgolgiosomeroughendoplasmicreticulumandsmoothendoplasmicmodelgrouphadamoreincreasedserumlevelofPAIIandETthanthoseofthecontrolgroup,andshowedthesignificantdifference(，).TheTCMgrouphadasignificantlylowerserumlevelofPAIIandETthanthoseofthemodelgroup().TherewerenosignificantdifferencesbetweenthenormalgroupandtheTCMgrouponserumlevelofPAII().TheTCMgrouphadmoredecreasedlevelofETthanthoseofthenormalgroup().［Conclusion］ThemorphologicchangesoftheendothelialcellsandincreaseofETandPAIIwerefoundinthePCOSmodelrat，indicatingbloodstasiswasonepathogenesisofherbsforactivatingbloodstasiscouldmorphologicallyrepairdamagedendothelialcells,regulatetheirfunctions.

Keywords:PCOS；animalmodel；activatingbloodstasis；endothelialcell

根據(jù)臨床實(shí)踐多囊卵巢綜合征患者即使無(wú)血瘀證的外在征象，臨床上在辨證施治的同時(shí)，適當(dāng)佐以活血化瘀之法，有助于提高療效，從而提高排卵率。根據(jù)“以方測(cè)證”的原則，推測(cè)PCOS存在血瘀的微觀病理改變。因此，本研究建立PCOS大鼠模型，觀察內(nèi)皮細(xì)胞功能和形態(tài)變化及活血化瘀中藥對(duì)其影響，尋求活血化瘀中藥治療多囊卵巢綜合征的微觀證據(jù)。

1材料與方法

材料

SD雌性大鼠30只，SPF級(jí)，體重g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(粵)2003－0001粵監(jiān)證字2005A031。胰島素注射液(沈陽(yáng)濟(jì)世制藥有限公司)、注射用人絨毛膜促性腺激素(HCG)(麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠)、FSH、LH、E2、T檢測(cè)試劑盒、PAI1檢測(cè)試劑盒、胰島素檢測(cè)試劑盒、內(nèi)皮素檢測(cè)試劑盒?；钛龇剿?，煎沸濃縮，制成/ml，4℃保存?zhèn)溆谩Ｖ兴庯嬈蓮V州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供。

方法

動(dòng)物分組及處理

30只大鼠隨機(jī)分為正常組對(duì)照、模型組、中藥組，每組10只。每周稱錄體重1次，每天進(jìn)行陰道涂片檢查。2周后，模型組依照Poretsky法［1］每只動(dòng)物皮下注射，2次/d，共9d；胰島素注射液于第1～11d內(nèi)自/d開(kāi)始，逐漸遞增至/d，并按此劑量維持至22d，以5％葡萄糖溶液替代日常飲水中藥組給予中藥按25g/kg灌胃，每天9：00灌1次，連續(xù)21d。正常對(duì)照組每天注射等容積生理鹽水并灌胃給予等體積常水。末次給藥后禁食過(guò)夜，翌日動(dòng)物稱重，乙醚麻醉后取眼眶靜脈血后，分離血清，置-20℃冰箱保存，待放射免疫測(cè)定FSH、LH、E2、T、ET、INS，酶免測(cè)定PAI1。

卵巢組織觀察

取其卵巢，去除卵巢表面的脂肪組織，10％甲醛液固定，酒精逐級(jí)脫水，透風(fēng)，浸蠟包埋，5μm切片，HE染色，光鏡觀察。

內(nèi)皮細(xì)胞觀察

％水合氯醛注入腹腔，將大鼠主動(dòng)脈從主動(dòng)脈根部至骼總動(dòng)脈分叉處取出，剝離外層結(jié)締組織，從腹側(cè)而縱行剝開(kāi)，生理鹽水沖洗干凈，％戊二醇初固定后，4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。％戊二醇PBS固定液40C固定2h，PBS緩沖液4℃洗滌2次；再以1％鋨酸PBS固定液40C固定2h、PBS緩沖液漂洗2次；70％～100％梯度酒精、丙酮順序脫水；Epon812包埋劑常規(guī)電鏡包埋，LKBV型超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾－檸檬酸鉛雙重染色各10min，制備透射電鏡標(biāo)本，采用透射電鏡觀察并拍照。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。

2結(jié)果

體重變化

處理前各組體重差異無(wú)顯著性。給藥后，模型組實(shí)驗(yàn)后體重比正常對(duì)照組體重明顯增加，差異有顯著性；中藥組低于模型組，但差異無(wú)顯著性。

陰道脫落細(xì)胞觀察

處理前各組動(dòng)物的陰道涂片均有明顯的性周期變化。約第10天左右完成HCG給藥后，模型組動(dòng)物陰道脫落細(xì)胞持續(xù)角化，性周期變化基本消失，其中7只大鼠呈典型間情期表現(xiàn)。正常對(duì)照動(dòng)物維持規(guī)律性的動(dòng)情周期，可見(jiàn)陰道分泌物拉絲現(xiàn)象。中藥組5只動(dòng)物維持規(guī)律性的動(dòng)情周期，

卵巢形態(tài)學(xué)觀察

卵巢大體解剖學(xué)改變

正常對(duì)照組卵巢色澤紅，表面多個(gè)紅點(diǎn)或紫點(diǎn)；模型組卵巢表面較蒼白，體積增大，見(jiàn)較多囊狀擴(kuò)張的卵泡。中藥組部分表面蒼白，部分表面見(jiàn)紅紫色斑點(diǎn)。

卵巢光鏡檢查

正常對(duì)照組見(jiàn)黃體及不同發(fā)育階段的卵泡，卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞多為5～6層，形態(tài)完整，排列整齊，卵泡腔內(nèi)可見(jiàn)卵丘、卵細(xì)胞、放射冠、透明帶結(jié)構(gòu)。模型組囊性擴(kuò)張的卵泡增多，其卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞或放射冠消失，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少至1～2層，排列紊亂，間質(zhì)纖維組織增生明顯，卵泡膜層增厚，黃體組織數(shù)量明顯比正常對(duì)照組減少，有50％(5/10)的卵巢未見(jiàn)黃體形成。中藥組60％的卵巢見(jiàn)黃體，黃體數(shù)量比模型組明顯增多，顆粒細(xì)胞多為4～6層，形態(tài)完整，排列整齊。

內(nèi)皮細(xì)胞透射電鏡觀察

正常對(duì)照組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞扁平完整，沿血管長(zhǎng)軸排列，內(nèi)皮連續(xù)性完好，其相鄰內(nèi)皮細(xì)胞相互重疊呈緊密接合，內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)較少，內(nèi)皮細(xì)胞下連接緊密、間隙窄，內(nèi)皮細(xì)胞完整，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)清晰。模型組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞收縮，內(nèi)皮細(xì)胞間的連接失去正常形態(tài)，連接局部開(kāi)大，基底膜不連續(xù)，細(xì)胞膜損傷、不完整；胞質(zhì)內(nèi)空泡明顯增多，線粒體膨脹，嵴溶解、斷裂、消失；細(xì)胞核聚集，異染色質(zhì)增多。中藥組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞間連接較緊密，線粒體無(wú)明顯腫脹，嵴清晰，吞飲泡和溶酶體增多，胞質(zhì)偶見(jiàn)空泡。

血生化指標(biāo)比較

血清FSH、LH、T、INS變化

模型組的血清LH、T、INS比正常對(duì)照組增高，差異有顯著性，F(xiàn)SH降低，但差異無(wú)顯著性。中藥組與正常組比較，差異無(wú)顯著性；與模型組比較LH明顯降低，T、INS降低不明顯，F(xiàn)SH增高，但差異無(wú)顯著性。表1血清內(nèi)分泌指標(biāo)比較

血漿PAI1、ET水平變化

模型組血漿PAI1、ET比正常對(duì)照組增高。中藥組與正常組比較，PAI1水平無(wú)顯著差異，ET增高；較模型組ET、PAI1降低。表2血漿PAI1、ET水平變化

3討論

研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙可導(dǎo)致高血壓、糖尿病或糖耐量異常及血脂紊亂等代謝性疾病發(fā)生和聚集，過(guò)量胰島素與細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子相互作用促使動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展［2］。內(nèi)皮功能障礙是胰島素抵抗綜合征的一個(gè)獨(dú)立組成部分［3］。ET是內(nèi)皮源性收縮因子中研究最多且被認(rèn)為是最強(qiáng)的血管收縮劑之一，是血管內(nèi)皮損傷性疾病的共同致病因子，被公認(rèn)為反映EC損傷的特異性首選指標(biāo)，目前尚未見(jiàn)ET與多囊卵巢綜合征關(guān)系的報(bào)道。PAI1是纖溶系統(tǒng)的重要組成成分，在血管內(nèi)皮細(xì)胞合成釋放，是一個(gè)重要的獨(dú)立的心血管疾病危險(xiǎn)因素［4］，與IR密切相關(guān)。糾正胰島素抵抗導(dǎo)致的纖溶系統(tǒng)活性異常，也是預(yù)防IR合并心血管疾病的重要環(huán)節(jié)。Glueck等［6］認(rèn)為，PCOS患者的各種癥狀可能與其血纖溶能力有關(guān)，PAI1的活性與PCOS患者的流產(chǎn)率呈正相關(guān)。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)VEC損傷與血瘀證密切相關(guān)，活血化瘀藥物抗內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用是得到公認(rèn)的。趙建宏等［7］采用鹽酸腎上腺素制劑復(fù)制大鼠VEC損傷模型，觀察活血化瘀中藥對(duì)VEC功能的影響，結(jié)果表明：活血化瘀中藥能減少VEC損傷所致的脫落，增強(qiáng)VEC的抗凝、抗聚功能，具有良好的VEC保護(hù)作用。王青［8］報(bào)告血府逐瘀湯能明顯降低血瘀模型兔血漿ET的含量、升高PGI2的含量，并且可增強(qiáng)tPA活性，對(duì)PAI活性具有抑制作用，但對(duì)正常兔的以上指標(biāo)沒(méi)有影響，說(shuō)明血府逐瘀湯具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能的作用。

本研究表明PCOS大鼠模型存在內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)改變，ET、PAI1升高，說(shuō)明PCOS有血瘀的病理基礎(chǔ)，為臨床治療PCOS辨證基礎(chǔ)上輔以活血化瘀之法治療提供微觀依據(jù)?；钛鲋兴幙杉m正PCOS大鼠異常的內(nèi)分泌水平，降低PAI1、ET水平，修復(fù)受損傷的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，對(duì)防治并發(fā)癥有重要意義。

【參考文獻(xiàn)】

［1］PoreskyL，ClemonsJ，BogovichK.Hyperinsulineniaandhumanchorionicgonadotropinsynergisticallypromotethegrowthofovarianfollicularcystsinrats［J］.Metabolism，1992，41(8)：903910.

［2］朱族云，劉坤申.胰島素抵抗與內(nèi)皮細(xì)胞障礙團(tuán)［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)·內(nèi)分泌學(xué)分冊(cè)，2002，22(9)：319320.

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［4］MertensI，VanderPlankenM,Cor