反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第一頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五反相液相色譜法流動(dòng)相的選擇

固定相對(duì)分離影響回顧常用的有機(jī)溶劑及其選擇性流動(dòng)相pH值的影響流動(dòng)相和固定相的優(yōu)化梯度洗脫程序柱溫的影響應(yīng)用舉例其他關(guān)鍵細(xì)節(jié)概要第二頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五色譜分離的終極目標(biāo)：關(guān)鍵組分的分離第三頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五反相液相色譜流動(dòng)相固定相:

鍵合相類型(C18vs苯基)

顆粒類型(核-殼vs整體硅膠)流動(dòng)相:

溶劑的選擇(乙腈vs甲醇)

流動(dòng)相pH

溫度

梯度第四頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

固定相對(duì)分離影響回顧第五頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五Kinetex核-殼技術(shù)2.6um色譜柱可以提高3倍柱效（與5um全多孔比較）提高柱效改善分離第六頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五提高柱效改善分離第七頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五固定相選擇性對(duì)分離度的影響回顧1疏水性立體互動(dòng)氫鍵給予

氫鍵接受陽(yáng)離子選擇性鍵合相與樣品的交互作用:第八頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五9C18Polar-RP1+212C18Phenyl固定相選擇性對(duì)分離度的影響回顧2第九頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五LC實(shí)驗(yàn)室，一定要有一套互補(bǔ)性強(qiáng)的色譜柱相關(guān)物質(zhì)檢查之系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)第十頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五各種不同基材色譜柱性能比較選擇正確的固相載體

固定相選擇性對(duì)分離度的影響回顧3第十一頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五Gemini?3uC18全多孔性載體

從分析到制備

Rs1&2=1.27背壓=264Bar塔板數(shù)=16700Onyx?C18整體技術(shù)載體

對(duì)生物樣品接受度高

Rs1&2=1.35背壓=86Bar塔板數(shù)

=13800Kinetex?C18核-殼技術(shù)載體提升分離度

Rs1&2=1.61背壓=340Bar塔板數(shù)=20300固定相選擇性對(duì)分離度的影響回顧4第十二頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

固定相選擇性對(duì)分離度的影響回顧5推薦的固定相選擇必備工具:1、反相色譜柱選擇終極指南畫報(bào)2、反相色譜柱選擇終極指南畫冊(cè)3、反相柱篩分工具第十三頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五14有機(jī)溶劑的選擇

第十四頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五常用的有機(jī)溶劑流動(dòng)相的選擇比固定相的選擇更具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)樗倪x擇的沒有限制的。然而，在實(shí)際的方法開發(fā)中，我們都會(huì)大大縮小選項(xiàng)，集中精力在那些會(huì)帶給我們最大成功可能性的條件上典型的反相溶劑:弱溶劑: 水/緩沖鹽強(qiáng)溶劑: 乙腈(64)

甲醇(34)

混合溶劑(1) THF(1)使用頻率第十五頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五選擇溶劑的考慮因素一種溶劑的強(qiáng)度取決于疏水性的強(qiáng)弱。溶劑強(qiáng)度會(huì)決定洗脫下來一個(gè)給定化合物所需的量。反相溶劑的強(qiáng)度:

水： 0

甲醇 2.6

乙腈 3.1THF 4.4溶劑選擇需要考慮的其他因素：甲醇-粘度較高，在小粒徑或長(zhǎng)柱提高流速時(shí)會(huì)受到限制乙腈-價(jià)格相對(duì)要高四氫呋喃-低波長(zhǎng)下有紫外吸收，粘度高

溶劑強(qiáng)度第十六頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五溶劑強(qiáng)度:乙腈Vs甲醇35%甲醇色譜柱: Gemini5μmC6-Phenyl,150x4.6mm流動(dòng)相: 20mM磷酸二氫鉀（pH2.5）%有機(jī)溶劑如圖所示流速: 1.0mL/min檢測(cè)波長(zhǎng):220nm1.糖精2.對(duì)羥基苯甲酸3.山梨酸4.脫氫乙酸5.對(duì)羥基苯甲酸甲酯20%乙腈用乙腈時(shí)分析物更早洗脫下來（即使乙腈的百分比更低）用乙腈洗脫的時(shí)候，洗脫順序發(fā)生了變化第十七頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五溶劑選擇性給定溶劑的洗脫強(qiáng)度由它的疏水性決定（如，庚烷比己烷強(qiáng)，因?yàn)樗氖杷愿鼜?qiáng)）然而，溶劑的選擇性，是由它的極性性質(zhì)所決定的（如，庚烷和己烷都具有相同的溶劑選擇性）乙腈有偶極矩，但是在氫鍵作用下又是非常弱的質(zhì)子接受體四氫呋喃在氫鍵作用下能接受質(zhì)子，但不能給予質(zhì)子甲醇在氫鍵作用下既是強(qiáng)的質(zhì)子給予體又是質(zhì)子接受體第十八頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五用不同的溶劑優(yōu)化4種類固醇的分離

溶劑選擇性第十九頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五溶劑的篩選(等度條件方法)1.從高比例乙腈開始逐步減少，直到k‘在2-10之間

（如果可能）80%AcCNk’=025%AcCNk’~621%AcCNk’~1140%AcCNk’~0.8第二十頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五溶劑的篩選(等度條件方法)2.用其他溶劑重復(fù)操作:第二十一頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五苯基色譜柱溶劑的選擇在任何反相的方法中，選擇乙腈或甲醇會(huì)對(duì)最終方法的選擇性有顯著的影響。然而，當(dāng)用苯基固定相的時(shí)候（如Lunaphenyl-Hexyl;SynergiPolar-RP），你會(huì)發(fā)現(xiàn)甲醇具有更好的選擇性，因?yàn)樗沟帽交潭ㄏ嗟膒i-pi作用更為明顯。這很可能是因?yàn)橐译媲杌蟨i電子影響了分析物上的pi電子和固定相苯環(huán)上的pi電子之間的作用，而甲醇不會(huì)有這樣的影響。乙腈上的氰基會(huì)干擾固定相苯環(huán)與分析物分子之間的pi-pi作用甲醇在氫鍵作用下既是強(qiáng)的質(zhì)子給予體又是質(zhì)子接受體第二十二頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五苯基色譜柱溶劑的選擇色譜柱: Luna5mC18(2)150x4.6mm Luna5mPhenyl-Hexyl150x4.6mm流動(dòng)相: A:20mM磷酸二氫鉀pH2.5 B:27%乙腈或

50%甲醇流速: 1.0mL/min化合物: 北美黃蓮提取物

1.黃蓮堿

2.小檗堿第二十三頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五苯基色譜柱溶劑的選擇27:73乙腈

:20mM磷酸二氫鉀pH2.5LunaC18(2)LunaPhenyl-Hexyl第二十四頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五苯基色譜柱溶劑的選擇50:50甲醇

:20mM磷酸二氫鉀pH2.5LunaC18(2)LunaPhenyl-Hexyl第二十五頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五26緩沖鹽和流動(dòng)相pH值的作用第二十六頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五反相色譜中緩沖鹽的選擇對(duì)于HPLC方法開發(fā)來說，從數(shù)量眾多的緩沖鹽中選擇出正確的緩沖鹽，非常不容易但事實(shí)不是這樣,因?yàn)橹恍鑾追N緩沖鹽就能解決大多數(shù)問題!!估計(jì)流動(dòng)相pH值時(shí)的實(shí)際考慮：1.目標(biāo)物質(zhì)的穩(wěn)定性2.固定相在低pH值條件下水解酸性強(qiáng)于TFA時(shí)，就會(huì)造成固定相流失減少保留，暴露的硅醇基不同廠家/品牌的填料的穩(wěn)定極限不同3.高pH值條件下硅膠溶解一般的硅膠基質(zhì)固定相穩(wěn)定至pH～8

保護(hù)性鍵合（如Luna）穩(wěn)定提高至pH～10

有機(jī)硅膠雜化（如Gemini）穩(wěn)定提高至pH～12第二十七頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五反相色譜中緩沖鹽的選擇第二十八頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五反相色譜中緩沖鹽的選擇低pH緩沖鹽

pKaRangeTFA<2<2.5磷酸2.11.1-3.1甲酸*3.82.8-4.82.54.57.08.510中性pH緩沖鹽

pKaRange磷酸鹽(pK2)7.26.2-8.2高pH緩沖鹽

pKaRange碳酸氫鹽pK210.39.3-11.3第二十九頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五pH值對(duì)固定相的影響OSiOSiOSiOHOHOHOOOSiSiSipH<3.5OSiOSiOSiOOHOOOOSiSiSipH>3.5任何硅膠基質(zhì)的反相填料鍵合和端基封尾之后都會(huì)有一定的硅醇基殘留。這些硅醇基在pH3.5以上都能夠去質(zhì)子化。去質(zhì)子化的硅醇基能夠與堿性的物質(zhì)形成離子交換作用，造成峰形拖尾硅醇基質(zhì)子化離子交換減少峰形拖尾減少硅醇基去質(zhì)子化離子交換作用增加增加了峰形拖尾第三十頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五pH值對(duì)分析物的影響反相色譜最主要的保留機(jī)理是疏水作用。化合物離子化會(huì)使得他們具有極性化合物的行為，減少與固定相的疏水作用，降低保留能力分子的離子化狀態(tài)可以由流動(dòng)性的pH值決定。因此，流動(dòng)性的pH值能影響具有離子化基團(tuán)的分析物的保留性能?疏水性增強(qiáng)?更強(qiáng)保留?疏水性減小?更弱的保留?疏水性增強(qiáng)?更強(qiáng)保留?疏水性減小?更弱的保留第三十一頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五pH值對(duì)分析物的影響第三十二頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五pH值對(duì)分析物保留行為的影響

H+堿化酸化水溶性流動(dòng)相烷烴類鍵合相第三十三頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五pH值對(duì)分析物保留行為的影響

H+堿化酸化水溶性流動(dòng)相烷烴類鍵合相H+第三十四頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五pH值對(duì)分析物保留行為的影響

BNABNAANB阿米替林(pKa9.4)=（B）堿性甲苯=(N)中性萘普生(pKa4.5)=（A）酸性第三十五頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五pH值對(duì)分析物保留行為的影響首選：pH＜pKa－2次選：pH＞pKa＋2第三十六頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五pH值對(duì)分析物保留行為的影響首選：pH＞

pKa＋

2次選：pH＜

pKa－

2第三十七頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五化合物pKa的預(yù)測(cè)第三十八頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五緩沖鹽的濃度一般采用20mM～50mM依據(jù)樣品濃度，建議為樣品濃度的5倍依據(jù)色譜柱硅羥基活度，活度越大，需要濃度越大對(duì)堿性化合物，高濃度緩沖鹽可以減弱反相色譜柱的“陽(yáng)離子選擇性”梯度洗脫和在線混合時(shí)注意高濃度緩沖鹽的溶解性第三十九頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五反相色譜柱的陽(yáng)離子選擇性在硅膠表面的帶電硅醇基可與帶電堿性物質(zhì)產(chǎn)生離子吸引作用，可造成正面或負(fù)面的影響。

第四十頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五腎上腺素

陽(yáng)離子選擇性－改善極性堿的保留

LunaPFP(2)Luna?C18(2)第四十一頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

陽(yáng)離子選擇性－堿性物質(zhì)峰形變差Kinetex?PFPKinetex

XB-C18美沙酮

美沙酮芬太尼

芬太尼

第四十二頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五緩沖鹽濃度對(duì)陽(yáng)離子選擇性的影響Luna5uSCX100A250×4.6mm

乙腈：50mmol/l磷酸二氫鉀（PH3.0）（5：95）

第四十三頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五緩沖鹽濃度對(duì)陽(yáng)離子選擇性的影響Luna5uSCX100A250×4.6mm

乙腈：100mmol/l磷酸二氫鉀（PH3.0）（5：95）

第四十四頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五45流動(dòng)相和固定相的優(yōu)化第四十五頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五優(yōu)化流動(dòng)相選擇性溶劑篩選：乙腈，甲醇確定適合的緩沖鹽有調(diào)節(jié)pH值來調(diào)整保留和選擇性選擇固定相色譜柱高效C18是否有pH值的特殊限制？調(diào)節(jié)pH值來調(diào)整保留和選擇性選擇固定相色譜柱沒有用乙腈，甲醇在低pH值條件下篩選第四十六頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五47優(yōu)化流動(dòng)相和固定相分析尼古丁及其代謝物尼古丁(pKa~8)可替寧新煙堿去甲煙堿羥基可替寧OH第四十七頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五優(yōu)化流動(dòng)相和固定相KinetexC18是否有pH值的特殊限制？沒有用乙腈在低pH值條件下篩選第四十八頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五49尼古丁和降解產(chǎn)物：初始低pH值條件篩選流動(dòng)相：A0.1%甲酸水溶液

B0.1%甲酸乙腈溶液梯度：10分鐘內(nèi)B%從5%變?yōu)?5%流速：1.5ml/min檢測(cè)器：254nm化合物：尼古?。?.1%）.進(jìn)樣1ul尼古丁(pKa~8.5)+CH3第四十九頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五優(yōu)化流動(dòng)相和固定相KinetexC18是否有pH值的特殊限制？沒有用乙腈在低pH值條件下篩選調(diào)節(jié)pH值來調(diào)整保留和選擇性第五十頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五51流動(dòng)相：A10mM碳酸氫銨pH10.5B乙腈梯度：10分鐘內(nèi)B%由5%變?yōu)?5%流速：1.5ml/min檢測(cè)器：254nm化合物：尼古?。?.1%）進(jìn)樣量1ul尼古丁及其代謝物：高pH條件下篩選，增加保留第五十一頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五優(yōu)化流動(dòng)相和固定相KinetexC18是否有pH值的特殊限制？沒有用乙腈在低pH值條件下篩選調(diào)節(jié)pH值來調(diào)整保留和選擇性Kinetex在pH10.5條件下不穩(wěn)定有機(jī)硅膠雜化GeminiNX3umC18第五十二頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五53尼古丁及其代謝物：最終方法用雜化顆粒色譜柱：流動(dòng)相：pH10.5A20mM碳酸氫銨B100%乙腈梯度時(shí)間B%0.00103.00783.10105.0010流速：0.5ml/min進(jìn)樣體積：10ul溫度：25℃第五十三頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五梯度分析第五十四頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五55梯度分析梯度洗脫的目的在于在同一個(gè)色譜運(yùn)行下分離疏水差異很大，并且需要很長(zhǎng)時(shí)間才能在等度洗條件下脫完全的樣品。梯度洗脫：峰形更尖銳，更好定量改善對(duì)最后洗脫下來的小峰的檢測(cè)適于運(yùn)行完樣品后對(duì)色譜柱的清洗和再生適于摸索分析條件色譜柱：流動(dòng)相：70:300.1%三氟乙酸水溶液:0.1%三氟乙酸乙腈流速：2.0ml/min組成：1.硫脲（標(biāo)記為t0）4.苯乙酮7.苯戊酮

2.咖啡因5.鄰苯二甲酸二甲酯

3.苯酚6.苯丁酮

第五十五頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五56梯度分析18min色譜柱：Luna?3μmC18(2)50x4.6mm流速：2.0ml/min流動(dòng)相：A：0.1%TFA水B：0.1%TFA乙腈1+23456776543214minA:B(70:30)B%5%→100%in5min第五十六頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五梯度斜率梯度斜率與等度洗脫中的溶劑強(qiáng)度相似等度洗脫溶劑強(qiáng)度提高溶劑強(qiáng)度減少分析時(shí)間同時(shí)降低了分離度減少溶劑強(qiáng)度增加分離度同時(shí)也增加了分析時(shí)間溶劑強(qiáng)度有時(shí)會(huì)影響選擇性梯度斜率提高梯度斜率減少運(yùn)行時(shí)間但是同時(shí)減少了分離度減緩梯度斜率增加了分離度但同時(shí)也增加了分析時(shí)間梯度斜率有時(shí)也會(huì)影響選擇性梯度洗脫的目的:優(yōu)化分離度的同時(shí)縮短分析時(shí)間第五十七頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五梯度分析示例：五種除草劑色譜柱：PhenomenexLunaC18

150x4.6mm第五十八頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五梯度分析5種除草劑在等度洗脫模式下：第五十九頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五梯度斜率對(duì)分離度的影響梯度斜率：1%/分鐘乙腈20-80%，60分鐘12345第六十頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五梯度斜率對(duì)分離度的影響梯度斜率：2%/分鐘乙腈20-80%，30分鐘第六十一頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五梯度斜率對(duì)分離度的影響梯度斜率：3%/分鐘乙腈20-80%，20min第六十二頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五梯度斜率對(duì)分離度的影響梯度斜率：4%/分鐘乙腈20-80%，15min分離度不夠!*增加梯度斜率將減少整體的保留時(shí)間同時(shí)也降低了分離度第六十三頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五起始有機(jī)相百分比對(duì)分離度的影響優(yōu)化后的方法=梯度斜率：3%/分鐘20-80%乙腈，20min乙腈30-90%，20min方法調(diào)整=梯度斜率：3%/min第六十四頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五梯度斜率：3%/分鐘，起始強(qiáng)溶劑=30%30-90%乙腈，20min分離度變小!起始有機(jī)相百分比對(duì)分離度的影響*提高起始強(qiáng)溶劑的量，降減少整體的保留和分離度第六十五頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五梯度方法開發(fā)1.從摸索梯度條件開始，判斷分析物的洗脫時(shí)間：5-95%有機(jī)相，X分鐘（1分鐘/厘米柱長(zhǎng)）150×4.6mm=B%5-95%15分鐘2、根據(jù)最早洗脫下來的組分，調(diào)整起始有機(jī)相比例3%有機(jī)溶劑等度保持X分鐘3.調(diào)整梯度斜率優(yōu)化分離度或關(guān)鍵物質(zhì)減緩斜率，提高分離度（5-95%B，20分鐘）增加斜率，如果分離度足夠（5-95%B，12分鐘）第六十六頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五梯度方法開發(fā)4、優(yōu)化截止有機(jī)相比例作為結(jié)束梯度截止在65%B5.調(diào)整起始有機(jī)相比例縮短運(yùn)行時(shí)間（如果沒有極性組成的限制） 5-65%B，18分鐘 10-70%B，18分鐘 15-75%B，18分鐘第六十七頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五梯度程序方法轉(zhuǎn)移時(shí)的微調(diào)梯度洗脫–最小化滯后體積減少循環(huán)時(shí)間PumpAPumpBDetectorInjectorMixer第六十八頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五69柱溫的影響第六十九頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五方法開發(fā)中柱溫的應(yīng)用 HPLC方法開發(fā)中溫度的應(yīng)用非常具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)樗鼘?duì)選擇性的影響不可預(yù)知升高溫度將會(huì)：1.減少流動(dòng)相粘度和背壓。這樣的話可以用更快的流速，或者用更長(zhǎng)/粒徑更小規(guī)格的色譜柱2.縮短洗脫時(shí)間3.提高方法的重現(xiàn)性（與室溫下的操作相比） 然而，不可能確定升高溫度是否有利于還是不利于樣品的分離。對(duì)于一復(fù)雜的分離來說，色譜結(jié)果中一份的提高幾乎都會(huì)伴隨著其他部分的減少第七十頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五方法開發(fā)中溫度的應(yīng)用℃第七十一頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五方法開發(fā)中溫度的應(yīng)用在我們的方法開發(fā)工作中：1.初始方法會(huì)設(shè)在30℃色譜柱篩選流動(dòng)相的選擇和優(yōu)化2.更高溫度的應(yīng)用僅在： 需要降低柱壓 （通常伴隨著提高流速或使用更長(zhǎng)的柱子） 30度下不能達(dá)到理想的分離度第七十二頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五73方法開舉例1：梯度優(yōu)化和固定相篩選第七十三頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五巴比妥酸鹽的臨床檢測(cè) 巴比妥酸鹽是CNS鎮(zhèn)定劑，用于減少麻醉，治療焦慮和失眠，但同時(shí)常被濫用 LC/MS分析這類化合物的困難在于異戊巴比妥和戊巴比妥是異構(gòu)體，分子量相同，所以必須達(dá)到基線分離才行異戊巴比妥pKa=7.8戊巴比妥第七十四頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五分離目標(biāo)：異戊巴比妥和戊巴比妥分離流動(dòng)相和固定相的優(yōu)化堿性樣品信息：無pH值限制樣品干凈溶劑?10cm乙腈，粘度低緩沖鹽?低pH值（甲酸）第七十五頁(yè)，共八十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五核-殼C18色譜柱：初始的梯度分析條件1、迅速，陡峭的梯度斜率確定分析物的大概情況10-90%B5min;16%/min減小梯度斜率保