基因的表達(dá)與調(diào)控技術(shù)第一頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五基因的結(jié)構(gòu)1)基因的上游區(qū)含有控制基因表達(dá)調(diào)控的順序,

通常將這些順序稱之為反式因子.

2)基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)包含:

外顯子:

在轉(zhuǎn)錄加工后輸出細(xì)胞核的順序,即編碼mRNA的順序.

內(nèi)含子:

在轉(zhuǎn)錄加工后被切除的順序,非編碼順序.3)mRNA的順序組成:

5’非翻譯區(qū):可調(diào)控翻譯起始

3’非翻譯區(qū):可調(diào)控翻譯終止多肽鏈編碼區(qū)(密碼子組成區(qū),或稱開放讀框,openreadingframe,ORF).第二頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五以轉(zhuǎn)錄起始點為分界線,在其5’端的順序稱為基因的上游區(qū),在其3’端的順序稱為基因的下游區(qū).基因的結(jié)構(gòu)第三頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五DNA的編碼鏈

-

正鏈(+)轉(zhuǎn)錄時以負(fù)鏈(-)或無義鏈為模板,按堿基配對法則合成與編碼鏈或正鏈(+)順序相同的RNA.第四頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五2基因突變細(xì)胞中核酸序列的改變通過基因表達(dá)有可能導(dǎo)致生物遺傳特征的變化。這種核酸序列的變化稱為基因突變(mutation)。基因突變可以是DNA序列中單個核苷酸或堿基發(fā)生改變，也可以是一段核酸序列的改變。DNA序列中涉及單個核苷酸或堿基的變化稱為點突變。在一個基因內(nèi)發(fā)生的點突變通常有兩種情況：一是一種堿基或核苷酸被另一種堿基或核苷酸所替換；二是一個堿基的插入和缺失第五頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五一種堿基被另一種替換

點突變——替換第六頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五同義突變：不改變相應(yīng)的氨基酸序列（密碼子的簡并性）錯義突變：改變了氨基酸序列

點突變——替換第七頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五錯義突變的例子——鐮狀細(xì)胞貧血癥編碼血紅蛋白b肽鏈上一個決定谷氨酸的密碼子GAA變成了GUA，使得b肽鏈上的谷氨酸變成了纈氨酸，引起了血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了根本的改變。第八頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

點突變——插入或缺失造成翻譯過程中其下游的三聯(lián)密碼子都被錯讀，產(chǎn)生完全錯誤的肽鏈或肽鏈合成提前終止。－－移碼突變第九頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五三或三的整數(shù)倍核苷酸的插入或缺失，僅僅添加或去除一些密碼子或者間隔開原來相鄰密碼子，不影響閱讀框。

神經(jīng)退行性疾病亨廷頓氏病，串聯(lián)重復(fù)序列5’-CAG-3’的不正常擴(kuò)增。正常人中有10～35個拷貝，病人中36～120個拷貝第十頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

基因突變的原因多種多樣：自發(fā)突變DNA復(fù)制錯誤造成堿基的替換、插入或缺失等自發(fā)突變

DNA聚合酶的錯誤：E.coli中的錯誤率10-7，堿基的酮式和烯醇式互變異構(gòu)DNA損傷或突變的修復(fù)機(jī)制

E.coli基因組復(fù)制的總體錯誤率為10-10到10-11,相當(dāng)于每拷貝1000次出現(xiàn)一次未校正的復(fù)制錯誤

DNA修復(fù)缺陷導(dǎo)致人類的疾?。褐愿善ぐY第十一頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五誘發(fā)突變外界因素如某些化學(xué)物質(zhì)［誘變劑］、紫外線、電離輻射等也可能誘導(dǎo)基因突變的發(fā)生電離輻射和紫外線：白血病和皮膚癌芳香烴類：皮膚癌黃曲霉素：肝癌亞硝胺：肝癌，食道癌，鼻咽癌吸煙：肺癌第十二頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五胸腺嘧啶的酮式與烯醇式互變第十三頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五利用基因突變進(jìn)行生物育種：

傳統(tǒng)抗生素高產(chǎn)菌種的誘變篩選。紫外線，Co60，NTG，等

菌種產(chǎn)量（單位/ml）野生型青霉菌20突變型青霉菌(X射線,紫外線照射等)50000～60000第十四頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

染色體的畸變?nèi)旧w數(shù)目的變異整倍體變異：多倍體，單倍體非整倍體變異：三體，缺體染色體結(jié)構(gòu)的變異缺失（deletion）重復(fù)（duplication）易位（translocation）倒位（invertion）第十五頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

染色體的數(shù)量變異Down氏綜合癥（21三體）第十六頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五Down氏綜合癥發(fā)病率與母親年齡有關(guān)。母親20歲時約2000新生兒中有一例患者；30歲前略有增加35歲以后約300例中有一個患者；40歲后100例中有一例；45歲后50例中有一例。Down氏綜合癥群體發(fā)病率1/800。第十七頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五染色體的結(jié)構(gòu)變異人類的貓叫綜合癥：第5號染色體缺失（短臂缺失）患兒發(fā)出咪咪聲，耳位低下，智商僅20～40.第十八頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五DNA轉(zhuǎn)錄和RNA翻譯，即遺傳信息從基因流向RNA又流向蛋白質(zhì)的過程總稱為基因表達(dá)在高度復(fù)雜的生物細(xì)胞及其多種多樣的代謝過程中，基因的表達(dá)是高度有序的。3原核生物基因的表達(dá)和調(diào)控基因表達(dá)可以在不同的水平上進(jìn)行調(diào)控，影響和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯等都屬于基因表達(dá)的調(diào)控。

如控制基因轉(zhuǎn)錄的開啟、關(guān)閉；翻譯速率的調(diào)節(jié)；基因表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）的活性的控制。

第十九頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五法國科學(xué)家Monod和Jacob發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌在不含乳糖的葡萄糖培養(yǎng)基中不會分泌β-半乳糖苷酶（參與乳糖降解代謝的主要酶）；相反，含有乳糖時，會合成β

-半乳糖苷酶，使乳糖水解。經(jīng)過一系列的實驗后，他們又發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌在沒有乳糖的環(huán)境中不產(chǎn)生編碼β-半乳糖苷酶的mRNA。1961年，他們提出了一種模型即乳糖操縱子學(xué)說。

大腸桿菌對乳糖的利用－－乳糖操縱子學(xué)說第二十頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

乳糖操縱子學(xué)說操縱子（operon）：由啟動子、操縱基因和結(jié)構(gòu)基因共同構(gòu)成的基因簇單位，稱為原核生物的操縱子。啟動子：RNA聚合酶結(jié)合的位點操縱基因：轉(zhuǎn)錄的開關(guān)，決定RNA聚合酶能否轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)基因：編碼b-半乳糖苷酶（Z）、透性酶（Y）和硫半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶（A）的基因。在操縱子上游存在調(diào)節(jié)基因，其表達(dá)產(chǎn)物為阻遏蛋白乳糖+阻遏蛋白，改變阻遏蛋白的形狀第二十一頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五第二十二頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五細(xì)菌中轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)第二十三頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五原核生物——操縱子，真核生物——？4真核生物基因的表達(dá)和調(diào)控真核生物基因表達(dá)與調(diào)控的復(fù)雜性：（1）真核生物具有由核膜包被的細(xì)胞核，其基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細(xì)胞核中，而翻譯則發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。（2）真核生物基因數(shù)目比原核生物多，大多數(shù)基因除了有不起表達(dá)作用的內(nèi)含子，另外還有更多調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼序列，真核生物所轉(zhuǎn)錄的前體mRNA必須經(jīng)過加工成熟后才進(jìn)入表達(dá)階段。第二十四頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五真核生物基因表達(dá)與調(diào)控的復(fù)雜性：（3）真核生物染色質(zhì)由DNA與5種組蛋白結(jié)合組成，它們折疊和纏繞形成核小體，核小體及染色質(zhì)進(jìn)一步折疊纏繞形成超級結(jié)構(gòu)狀態(tài)的細(xì)胞分裂中期染色體。染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)對基因的表達(dá)起總體控制作用。第二十五頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五真核生物基因表達(dá)的調(diào)控可發(fā)生在不同水平上染色質(zhì)水平的調(diào)控－－X染色體部分失活轉(zhuǎn)錄水平的控制前體mRNA的加工mRNA跨核膜的運輸調(diào)控細(xì)胞質(zhì)中mRNA的穩(wěn)定性mRNA的選擇性翻譯蛋白質(zhì)產(chǎn)物的活化和后加工第二十六頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五玳瑁貓的皮毛顏色第二十七頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五5基因與人類疾病精妙的基因表達(dá)和調(diào)控機(jī)制，保證了細(xì)胞中DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和各種代謝反應(yīng)的高效和有序性，從而保證了生命的健康。由于環(huán)境因素，或遺傳因素，或環(huán)境與遺傳因素的相互作用等，都可能導(dǎo)致基因突變的發(fā)生，也可能導(dǎo)致基因表達(dá)調(diào)控的失常。其結(jié)果便造成了某些與基因相關(guān)的人類疾病的發(fā)生。從分子水平來解釋某些與基因表達(dá)相關(guān)的人類重大疾病為基因診斷和治療提供了依據(jù)。第二十八頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

癌癥癌癥和心血管疾病成為威脅人類健康的兩大惡魔。癌是細(xì)胞生長與分裂失控引起的疾病，其根源是體細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與分裂的基因異常表達(dá)。癌癥的發(fā)生是環(huán)境和遺傳因素共同決定的。環(huán)境致癌因子遺傳因素腫瘤發(fā)生的家族聚集現(xiàn)象；種族間的差異；遺傳易感性第二十九頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五肺癌肝癌胃癌皮膚癌乳腺癌子宮頸癌第三十頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

腫瘤發(fā)生的機(jī)理腫瘤細(xì)胞的最大特點是細(xì)胞的分裂失去控制，導(dǎo)致無規(guī)律的增生。這一過程在本質(zhì)上是控制細(xì)胞分裂的基因發(fā)生了突變。癌變通常發(fā)生在必需不斷更新的組織細(xì)胞，由于頻繁復(fù)制可積累突變。這些必需不斷更新的組織細(xì)胞由于接觸和受到許多物理化學(xué)因素的影響，易受損傷和發(fā)生遺傳變異。3)腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因可分為兩大類：

癌基因（oncogenes），它們能促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖；

腫瘤抑制基因（tumor-suppresorgene）或抑癌基因，它們能調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化而抑制腫瘤的發(fā)生。第三十一頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

細(xì)胞癌變的多步模型---結(jié)腸癌第三十二頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五組織學(xué)檢查，將腫瘤分成不同等級腫瘤基因的基因擴(kuò)增，用癌基因探針雜交基因芯片，評定腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)模式

在不同層面比較基因的表達(dá)水平正常和腫瘤細(xì)胞不同類型的腫瘤細(xì)胞同一腫瘤的組織來源不同的細(xì)胞腫瘤不同階段的細(xì)胞原位腫瘤和轉(zhuǎn)移的細(xì)胞來自不同患者的組織來源相似的細(xì)胞

提高對癌癥的診斷和治療能力第三十三頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

六、基因工程技術(shù)和應(yīng)用

1、基因工程技術(shù)

基因工程是生物技術(shù)的核心部分。

所謂基因工程(geneticengineering)就是有意識地把一個生物體中有用的目的基因轉(zhuǎn)入另一個生物體中，使后者獲得新的遺傳性狀或表達(dá)所需要的產(chǎn)物。重組DNA技術(shù)，又稱為基因或分子克隆技術(shù)，是基因工程的核心技術(shù)。該技術(shù)包括了一系列的分子生物學(xué)操作步驟。第三十四頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五重組DNA操作一般步驟：（1）獲得目的基因；（2）重組DNA分子的構(gòu)建；（3）轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染；（4）對轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定；（5）特定遺傳性狀的表達(dá)。第三十五頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五獲得需要的目的基因常用的方法：（1）直接從生物體中提取總DNA，構(gòu)建基因文庫(genelibrary)，從中調(diào)用目的基因；（2）以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的DNA片段，構(gòu)建cDNA文庫，從中調(diào)用目的基因；（3）利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）特異性地擴(kuò)增所需要的目的基因片段，等等。第三十六頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

一般來說，人的基因，要從人體的組織細(xì)胞中去找；小鼠的基因要從小鼠的組織細(xì)胞中去找。

從組織細(xì)胞中可以分離得到人/小鼠的全套基因，稱為基因文庫。

（1）獲得目的基因

到哪里去找目的基因？－基因文庫法第三十七頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

基因文庫的構(gòu)建將總DNA包含的基因組各片段分別克隆在質(zhì)?；蚴删w載體上，便構(gòu)成了該生物的基因文庫。第三十八頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

文庫中基因總數(shù)，就人來說約有3萬個基因。如何從中把需要的基因找出來？

“釣”基因－稱為印跡法（分子雜交）。利用堿基配對的原則，用一段小的已知的DNA片斷（探針）去尋找（“釣”）大的未知的基因片斷。

探針DNA片斷從何而來？

第三十九頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五1將樣品通過印跡技術(shù)轉(zhuǎn)到酯酰纖維薄膜上，以便操作；

2用已知小片斷DNA作為探針，互補(bǔ)結(jié)合需要找的基因片斷；

3由于探針DNA片斷已用放射性元素標(biāo)記，使膠片感光后可看出目的基因的位置。

探針顯色洗膜挑取陽性克隆并擴(kuò)增濾膜第四十頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

反轉(zhuǎn)錄人工合成互補(bǔ)DNA構(gòu)建基因文庫獲取目的基因存在的問題——

費時費事 內(nèi)含子序列反轉(zhuǎn)錄人工合成互補(bǔ)DNA方法的優(yōu)勢——獲取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因第四十一頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增目的基因PCR技術(shù)就是在體外中通過酶促反應(yīng)有選擇地大量擴(kuò)增（包括分離）一段目的基因的技術(shù)。加入4種物質(zhì)：

（1）作為模板的DNA序列；

（2）與被分離的目的基因兩條鏈各自5’端序列相互補(bǔ)的DNA引物（20個左右堿基的短DNA單鏈）；

（3）TaqDNA聚合酶；

（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）。第四十二頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）變性、退火、延伸三步曲變性：雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對和結(jié)合延伸：以目的基因為模板，合成互補(bǔ)的新DNA鏈第四十三頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）每一輪聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可使目的基因片段增加一倍30輪循環(huán)可獲得——230（1.07×109)個基因片段第四十四頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

（2）構(gòu)造重組DNA分子

載體與目的基因連接在一起形成重組DNA分子。

載體有好幾種，常用的有：

質(zhì)粒－－環(huán)狀雙鏈小分子DNA，適于做小片斷基因的載體。

噬菌體DNA－－線狀雙鏈DNA，適于做大片斷基因的載體。第四十五頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

載體載體是運送目的基因片段進(jìn)入宿主細(xì)胞的工具，目前最常用的載體包括細(xì)菌質(zhì)粒、l噬菌體、cosmid質(zhì)粒等。質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞中自然存在于染色體外可以自主復(fù)制的一段環(huán)狀DNA分子。進(jìn)入到宿主細(xì)胞中的一個質(zhì)?？梢源罅吭黾悠淇截悢?shù)。第四十六頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五1．該質(zhì)粒比較小，可以插入一段較長的DNA片段。2．進(jìn)入宿主細(xì)菌細(xì)胞后，pUC18在每個細(xì)胞中可復(fù)制形成大約500個拷貝。3．在pUC18中有一小段人為設(shè)計和插入的具有多種限制性酶切位點的序列，即多克隆位點

細(xì)菌質(zhì)粒pUC18第四十七頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五基因克隆獲得大量目的基因后，就要使其在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生需要的基因表達(dá)產(chǎn)物或使宿主生物具備所需的性狀，同時目的基因還能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳。這一過程就是遺傳轉(zhuǎn)化。若受體細(xì)胞是細(xì)菌，通常稱轉(zhuǎn)化；若受體細(xì)胞是動/植物細(xì)胞，通常稱轉(zhuǎn)染。（3)轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞和轉(zhuǎn)化子的篩選第四十八頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五遺傳轉(zhuǎn)化常用的方法載體法轉(zhuǎn)化——感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的介導(dǎo)法基因的直接轉(zhuǎn)移（1）高壓電脈沖電激穿孔（2）基因槍法（3）微注射法第四十九頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

pUC18質(zhì)粒的多克隆位點整合在lacZ基因中，該位點如果沒有插入外源目的基因，lacZ基因便可表達(dá)出半乳糖苷酶，如果平板培養(yǎng)基中含有IPTG和X-gal，X-gal便會被半乳糖苷酶水解成蘭色，大腸桿菌形成藍(lán)色克隆。在多克隆位點插入外源目的基因，破壞了lacZ基因的結(jié)構(gòu)，大腸桿菌形成白色的克隆利用lacZ基因的插入失活篩選重組質(zhì)粒第五十頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五pUC18還攜帶了氨卞青霉素抗性基因，可篩選重組質(zhì)粒。第五十一頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

（4）目的基因的表達(dá)

若需要讓克隆的基因表達(dá)和產(chǎn)生大量編碼蛋白，可對轉(zhuǎn)化的大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)使目的基因大量表達(dá)和積累。對表達(dá)產(chǎn)物分離純化便可獲得想要的產(chǎn)品。

通過DNA體外重組技術(shù)構(gòu)建的重組質(zhì)粒還可以直接用以轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，構(gòu)建基因缺失的突變株。第五十二頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器第五十三頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

以大腸桿菌為宿主菌進(jìn)行基因的克隆將目的基因克隆到大腸桿菌細(xì)胞中的操作步驟：1．獲得目的基因和質(zhì)粒載體；2．形成重組質(zhì)粒；3．制備感受態(tài)細(xì)胞，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞；4．培養(yǎng)大腸桿菌，讓重組質(zhì)粒及外源目的基因形成大量拷貝；5．篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞，進(jìn)行檢查或鑒定。第五十四頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五

2、基因工程的應(yīng)用

基因工程技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等各個領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

（1）在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

基因工程被用于大量生產(chǎn)過去難以得到或幾乎不可能得到的蛋白質(zhì)－肽類藥物。第五十五頁，共六十五頁，編輯于2023年，星期五胰島素500Kg牛胰10克胰島素200升發(fā)酵液10克胰島素干擾素1200升人血2－3萬美元/病人1升發(fā)酵液

200－300美元/病人凝血因子VIII1000升血漿