細(xì)菌標(biāo)本片的制備及革蘭氏染色革蘭氏染色法由丹麥病理學(xué)家ChristainGram于1884年創(chuàng)立，是細(xì)菌學(xué)中很重要的鑒別染色法。通過此法染色，可將細(xì)菌鑒別為革蘭陽性菌（G+）和革蘭陰性菌（G-）兩大類。有芽孢的桿菌和絕大多數(shù)球菌以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏陽性反應(yīng)?；【?、螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽孢桿菌都呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握細(xì)菌抹片的制備方法。2、掌握革蘭氏染色技術(shù)。2、了解革蘭氏染色原理。二、實(shí)驗(yàn)材料菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌革蘭氏染色液：草酸銨結(jié)晶紫染色液、革蘭氏碘液、95%乙醇、石碳酸復(fù)紅染色液載玻片、染色缸、吸水濾紙、顯微鏡、香柏油、鏡頭擦洗液、擦鏡紙等1.細(xì)菌標(biāo)本片制備：包括涂片、自然干燥、固定三步。（1）涂片：點(diǎn)燃酒精燈，用鑷子將浸泡在酒精中的載玻片取出，濾掉多余的酒精，在酒精燈上將剩余的酒精燒完，待載玻片完全干燥后，將載玻片置于載玻片支架上。用滴管滴一小滴生理鹽水于載玻片中央，注意生理鹽水不宜過多。取接種環(huán)在火焰上灼燒滅菌，待冷卻后，從培養(yǎng)皿內(nèi)釣取少許菌落，置于載玻片上的生理鹽水中涂抹混勻，使菌懸液在載玻片上形成均勻薄膜。注意接種環(huán)取菌時不宜過多；涂片必須均勻，不可過于濃厚。三、實(shí)驗(yàn)操作步驟水滴菌體涂片載玻片使菌懸液在載玻片上形成均勻薄膜（2）干燥：將涂片置于室溫下自然干燥；若天氣較冷時，可將標(biāo)本面朝上，在離酒精燈火焰較遠(yuǎn)處（溫度以不燙手為宜）烘干。注意：切勿緊靠火焰，溫度過高會改變甚至破壞細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)。（3）火焰固定將已干燥的抹片涂面向上，以鐘擺速度通過酒精燈火焰2-3次。待涂片冷卻后進(jìn)行染色。細(xì)菌抹片火焰固定目的：殺死細(xì)菌，染料能著色；細(xì)胞壁通透性增加，便于著色；菌附著于玻片，不被洗掉。

火焰固定

干燥2.革蘭氏染色程序：初染：將已干燥、固定好的抹片置于載玻片支架上，滴加2-3滴草酸銨結(jié)晶紫染色液于菌膜上（滴加染液的量以覆蓋菌膜部位為宜），染色1-2min。水洗：傾去染液，自來水沖洗。注意水流不宜過急、過大，不要直接沖在菌膜處。至洗出水無色為止。媒染：滴加2-3滴碘液覆蓋菌膜，染色1min。水洗：水洗方法同上。脫色：滴加2-3滴95%乙醇溶液，脫色30s后立即水洗，以終止脫色。水洗復(fù)染：滴加2-3滴石碳酸復(fù)紅染液，染色1-2min。水洗結(jié)晶紫初染碘液媒染95%乙醇脫色復(fù)紅復(fù)染干燥、固定好的抹片革蘭氏染色程序

水洗水洗水洗3、油鏡觀察將染色后的細(xì)菌抹片用吸水紙吸去過多水分，自然干燥或電吹風(fēng)吹干，用顯微鏡油鏡觀察菌片：在標(biāo)本片菌膜處滴一滴香柏油；將標(biāo)本片置于載物臺上；低倍鏡聚焦使圖像清晰；中倍鏡聚焦使圖像清晰；直接由中倍鏡鏡頭轉(zhuǎn)到低倍鏡鏡頭，再轉(zhuǎn)到油鏡鏡頭；用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋微調(diào)使圖像清晰；觀察菌體顏色、大小，形態(tài)。油鏡下可見：葡萄球菌菌體呈藍(lán)紫色，葡萄狀排列，為革蘭氏陽性菌（G+）；大腸桿菌菌體呈紅色，單個散在，為革蘭陰性菌（G-）。四、結(jié)果葡萄球菌大腸桿菌五、革蘭氏染色注意事項(xiàng)選用培養(yǎng)18--24h菌齡的細(xì)菌為宜。革蘭氏染色注意載玻片要潔凈，滴無菌水和取菌不宜過多，涂片要均勻、薄，不宜過厚?；鹧婀潭〞r不宜過熱，否則會改變甚至破壞細(xì)胞形態(tài)。水洗時不要直接沖洗涂面，而應(yīng)使水流從載玻片的一端流下；沖洗時水流不宜過急、過大，以免涂片薄層脫落。酒精脫色是染色成敗的關(guān)鍵，酒精脫色不宜過度。用水流沖洗時，不要直接對著涂片區(qū)沖洗。革蘭氏染色結(jié)果是否正確，95%乙醇脫色是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌；脫色過度，陽性菌會被誤染為陰性菌。六、革蘭氏染色原理革蘭氏陽性菌（G+菌）通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在G+菌細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物；由于G+菌細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，當(dāng)用95%乙醇溶液作脫色處理時，G+菌細(xì)胞壁因失水反而使細(xì)胞壁網(wǎng)孔縮小，再加上G+菌細(xì)胞壁不含類脂，故乙醇處理時G+菌細(xì)胞壁不會出現(xiàn)縫隙，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在G+菌細(xì)胞壁內(nèi)，使其仍呈紫色。革蘭氏陰性菌（G-菌）因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，用95%乙醇溶液脫色液時，以類脂為主的外膜迅速