放線菌的簡介放線菌形態(tài)結構放線菌的繁殖放線菌雜交概況和原理放線菌的雜交技術當前第1頁\共有28頁\編于星期三\6點放線菌簡介細菌的一個大類群，為革蘭氏陽性。多為腐生，少數(shù)為寄生。寄生型放線菌會引起放線菌病和諾卡氏病。是工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)品的主要生產(chǎn)菌種來源，尤其是抗生素、四環(huán)素、土霉素、卡那霉素等都由放線菌產(chǎn)生當前第2頁\共有28頁\編于星期三\6點放線菌的形態(tài)結構放線菌菌體為單細胞，大多數(shù)由分枝發(fā)達的菌絲組成。根據(jù)放線菌菌絲的形態(tài)和功能分為營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲和孢子絲三種.當前第3頁\共有28頁\編于星期三\6點營養(yǎng)菌絲又稱為初級菌絲體、一級菌絲體或基內(nèi)菌絲，匍匐生長于培養(yǎng)基內(nèi)，主要生理功能是吸收營養(yǎng)物。營養(yǎng)菌絲一般無隔膜；直徑0.2~0.8m；長度差別很大；短的小于100m，長的可達600m.有的產(chǎn)生色素：黃、橙、紅、紫、藍、綠、灰、褐、黑等，包括脂溶性和水溶性，脂溶性色素局限于菌絲，水溶性色素可在培養(yǎng)基中擴散。當前第4頁\共有28頁\編于星期三\6點氣生菌絲又稱為二級菌絲體。營養(yǎng)菌絲體發(fā)育到一定時，長出培養(yǎng)基外并伸向空間的菌絲為氣生菌絲。當前第5頁\共有28頁\編于星期三\6點

孢子絲當氣生菌絲發(fā)育到一定程度，其上分化出可形成孢子的菌絲即為孢子絲，又名產(chǎn)孢絲或繁殖菌絲。

當前第6頁\共有28頁\編于星期三\6點

放線菌主要通過形成無性孢子的方式進行繁殖，也可利用菌絲片斷進行繁殖。放線菌生長到一定階段，一部分菌絲形成孢子絲，孢子絲成熟便分化形成許多孢子，稱為分生孢子。孢子呈白、黃、綠、淡紫、粉紅、藍、褐、灰等顏色。繁殖方式當前第7頁\共有28頁\編于星期三\6點放線菌雜交原理放線菌只有一條環(huán)狀染色體，基因重組過程類似于大腸桿菌，大體上有以下四種遺傳體系。當前第8頁\共有28頁\編于星期三\6點混合培養(yǎng)營養(yǎng)缺陷型，菌絲間接觸、融合形成異核體。異核體：

在同一個細胞質里，存在兩種遺傳上不同的細胞核，在營養(yǎng)上互補。菌落表型是原養(yǎng)型?；蛐头謩e與親本之一相同，無重組體出現(xiàn)。沒有發(fā)生遺傳信息交換。

（1）異核現(xiàn)象當前第9頁\共有28頁\編于星期三\6點接合：異核細胞內(nèi)不同基因型的細胞核在雙方增殖過程中，發(fā)生部分染色體轉移或遺傳信息交換。接合導致部分合子形成。

（2）接合現(xiàn)象當前第10頁\共有28頁\編于星期三\6點部分合子：

是由一個供體染色體片段與一個受體染色體的整體相結合而形成的，但亦可能兩個親本都不完整當前第11頁\共有28頁\編于星期三\6點部分合子形成后，經(jīng)過一次單交換，產(chǎn)生的雜合的染色體組，即：異核系。異核系的菌落很小，遺傳類型各不相同。能在MM或SM上生長。但異核系的分生孢子影印到同樣培養(yǎng)基上就不能生長。（3）異核系的形成當前第12頁\共有28頁\編于星期三\6點異核系不穩(wěn)定，在菌落生長過程中，染色體重疊兩節(jié)段（二體區(qū)）的不同位置上發(fā)生交換后，能產(chǎn)生重組體孢子。異核系所產(chǎn)生的孢子幾乎全部是單倍體，而成為一個單倍的無性繁殖系。但是，重組體也可由部分合子經(jīng)過雙交換而產(chǎn)生。（4）重組體的形成當前第13頁\共有28頁\編于星期三\6點當前第14頁\共有28頁\編于星期三\6點放線菌的雜交過程（1）接合兩個不同基因型的菌株通過接合，供體菌株的部分染色體轉移到受體細胞中，形成局部結合子當前第15頁\共有28頁\編于星期三\6點（2）雜合系和重組體雜合系局部結合子形成后，在繁殖復制過程中，兩個不同基因型染色體進行一次交換，產(chǎn)生雜合系，使交換后的染色體不是環(huán)狀結構而是線狀的，并且在染色體的末端具有串聯(lián)的重復體。在復制過程中，開口的環(huán)狀染色體上基因再一次交換，產(chǎn)生不同基因型的重組雜合系。當前第16頁\共有28頁\編于星期三\6點（3）重組體雜合系或重組雜合系在以后的進一步繁殖復制過程中，雜合狀態(tài)染色體的不同區(qū)段還要進行幾次交換，才能形成不同類型的重組體。雜合系是形成重組體所必需的階段。當前第17頁\共有28頁\編于星期三\6點放線菌雜交技術

常用放線菌雜交方法：混合培養(yǎng)法玻璃紙轉移法平板雜交法當前第18頁\共有28頁\編于星期三\6點混合培養(yǎng)法兩親株是互補營養(yǎng)缺陷型，兩親株混合，接種到CM斜面上(其中一株產(chǎn)生孢慢時可多接一些)，孢子形成后制成單孢子懸浮液，然后在SM平板上分離，長出菌落即為重組體。當前第19頁\共有28頁\編于星期三\6點1．直接親本是雜交配對菌株直接親本要求具有營養(yǎng)缺陷型或抗性標記2．斜面混合培養(yǎng)取兩個直接親本新鮮培養(yǎng)的成熟孢子或菌絲，重疊接種到完全培養(yǎng)基上，在適當溫度下培養(yǎng)，根據(jù)選育目的決定培養(yǎng)時間。3．單孢懸液的制備培養(yǎng)后長出一層孢子。待孢子成熟后，加入適量的含0.01%月桂酸鈉的無菌水，輕輕刮下斜面孢子，轉入盛有玻璃珠的無菌三角瓶中，搖動10min，過濾，制成分散的單孢子懸液。然后離心洗滌，沉淀的孢子加無菌水制成單孢子懸液?；旌吓囵B(yǎng)法具體方法當前第20頁\共有28頁\編于星期三\6點4．重組體的檢出（1）原養(yǎng)型重組體的檢出：（2）異養(yǎng)型重組體的檢出：5．雜合系分析雜合系菌落的分離：重組體的鑒別：重組體獲得后，其中把原養(yǎng)型重組體進一步按育種程序迸行研究。

混合孢子液選擇培養(yǎng)基影印到基本培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基

混合孢子液基本培養(yǎng)基10-15d互養(yǎng)雜合體和回復突變原養(yǎng)性重組體當前第21頁\共有28頁\編于星期三\6點當前第22頁\共有28頁\編于星期三\6點玻璃紙雜交法原理：異核體帶有鏈霉素敏感的等位基因，在含鏈霉素的SM上不生長。敏感性親本和抗藥性親本因營養(yǎng)要求得不到滿足也不能在該SM上生長。而不帶鏈霉素敏感等位基因的兩直接親本的局部結合子則能在該SM上生長。使用本法必須具備兩個條件：第一，直接親本必須帶有兩個遺傳標記，即一個直接親本帶有一種營養(yǎng)要求和抗藥性（如抗鏈霉素）；而另一個直接親本則為對該藥物敏感（如對鏈霉素敏感）和帶有另一種營養(yǎng)缺陷型。當前第23頁\共有28頁\編于星期三\6點第二，選擇性培養(yǎng)基是帶有抗性藥物的補充培養(yǎng)基。

該方法是在選擇性培養(yǎng)基上挑選異核系菌落，其原理是：異核體帶有鏈霉素敏感的等位基因，在含有鏈霉素的選擇性培養(yǎng)基上不能生長。敏感性親本和抗藥性親本因為營養(yǎng)要求得不到滿足也不能在該選擇性培養(yǎng)基上生長。而不帶鏈霉素敏感等位基因的兩直接親本的局部結合子則能在該選擇性培養(yǎng)基上生長、繁殖成為異核系菌叢。當前第24頁\共有28頁\編于星期三\6點玻璃紙法平板雜交的具體方法（1）在兩個直接親本的新鮮、成熟孢子斜面中加入無菌水，輕輕刮下孢子，制成孢子懸液。（2）混合液接種到覆蓋在完全培養(yǎng)基平板上半透型的玻璃紙表面，置于適當溫度培養(yǎng)24h。待玻璃紙表面布滿一層基質菌絲而未長出氣生菌絲，這時可終止培養(yǎng)。（3）用無菌鑷子將玻璃紙以無菌操作轉移到CM+鏈霉素瓊脂平板上，室溫下繼續(xù)培養(yǎng)。（4）當基質菌絲停止生長，雜合系的氣生菌絲在玻璃紙表面開始生長，可用微針挑取雜合系的菌絲叢，進一步分析，檢出分離子。當前第25頁\共有28頁\編于星期三\6點分離子的檢出與鑒別方法一：事先準備好MM平板，在其上滴一點含有0.01%月桂酸鈉的無菌水，挑取雜合系菌絲叢于水滴中涂抹均勻，適溫培養(yǎng)即可長出各種分離子。方法二:挑取雜合系菌絲叢，加入到盛有一定量無菌水的試管內(nèi)，制備單孢子菌懸液，分離于完全培養(yǎng)基平板上，菌落形成后，用影印法復印到各種選擇性培養(yǎng)平板上，可以鑒別出不同類型的重組分離子。當前第26頁\共有28頁\編于星期三\6點玻璃紙雜交法法優(yōu)點玻璃紙雜交法不僅可以分離雜合系，而且可以分析雜合系。與混合培養(yǎng)法中的雜合系分析相比，玻璃紙雜交法較為簡單，時程也短。玻璃紙雜交法可以在一定時間間隔中斷