方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)重復(fù)性試驗(yàn)TP演示文稿當(dāng)前第1頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)優(yōu)選方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)重復(fù)性試驗(yàn)TP當(dāng)前第2頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)---重復(fù)性試驗(yàn)方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)

——重復(fù)性試驗(yàn)掌握：批內(nèi)精密度評(píng)價(jià)的基本原理、實(shí)驗(yàn)步驟及統(tǒng)計(jì)方法。熟悉：重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。了解：批間、日內(nèi)及日間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的區(qū)別當(dāng)前第3頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)什么是方法學(xué)評(píng)價(jià)方法學(xué)評(píng)價(jià)（evalution

of

methodology）是通過實(shí)驗(yàn)的途徑客觀評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)方法及其試劑分析性能的重要手段。其基本內(nèi)容是通過實(shí)驗(yàn)途徑，測(cè)定并評(píng)價(jià)方法的精密度與準(zhǔn)確度，在實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的是不精密度與不準(zhǔn)確度，不論精密度還是準(zhǔn)確度，強(qiáng)調(diào)的都是誤差，評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的過程就是對(duì)誤差的測(cè)定。方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)---重復(fù)性試驗(yàn)當(dāng)前第4頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)方法學(xué)評(píng)價(jià)常用技術(shù)性能指標(biāo)準(zhǔn)確度(accuracy)是指測(cè)定值與真值之間的符合程度，由于真值實(shí)際上也是一個(gè)近似值，所以準(zhǔn)確度往往用不準(zhǔn)確度來表示。精密度(precision)是指在重復(fù)性條件下對(duì)同一標(biāo)本進(jìn)行多次測(cè)定時(shí)，各測(cè)定值之間隨機(jī)誤差的大小。精密度常用標(biāo)準(zhǔn)差(s)或變異系數(shù)(CV%)來表示。方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)---重復(fù)性試驗(yàn)當(dāng)前第5頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)方法學(xué)評(píng)價(jià)常用技術(shù)性能指標(biāo)靈敏度(sensitivity)是指檢測(cè)系統(tǒng)可檢測(cè)出的最低分析物濃度，或稱檢測(cè)限。特異度(specificity，SPE)，又稱真陰性率(truenegativerate，TNR)，即實(shí)際無病按該診斷標(biāo)準(zhǔn)被正確地判為無病的百分比。它反映篩檢試驗(yàn)確定非病人的能力。方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)---重復(fù)性試驗(yàn)當(dāng)前第6頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)方法學(xué)評(píng)價(jià)常用技術(shù)性能指標(biāo)分析測(cè)量范圍(analysismeasurerange，AMR)是指對(duì)沒有進(jìn)行任何預(yù)處理（稀釋、濃縮等）的標(biāo)本，分析方法能夠直接測(cè)定出的待測(cè)物的范圍，也就是系統(tǒng)最終的輸出值（活性或濃度）與被分析物的活性或濃度成線性比例的范圍，即線性范圍。臨床可報(bào)告范圍(clinicalreportablerange，CRR)，是允許應(yīng)用樣本稀釋、濃縮和預(yù)處理后，分析方法可測(cè)定樣本中分析物的可靠范圍濃度。CRR是擴(kuò)展的AMR。方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)---重復(fù)性試驗(yàn)當(dāng)前第7頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)重復(fù)性試驗(yàn)重復(fù)性試驗(yàn)是在相同條件下，用同一方法、同一試劑和校準(zhǔn)品、同一臺(tái)儀器、在同一實(shí)驗(yàn)室由同一人操作對(duì)同一標(biāo)本在盡可能短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行多次分析測(cè)定（一般為20次），以獲得批內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。其結(jié)果反映各次測(cè)定結(jié)果間相互接近的程度。其目的在于評(píng)價(jià)或驗(yàn)證試驗(yàn)方法的隨機(jī)誤差或不精密度。包括批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)、日內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和日間重復(fù)性試驗(yàn)等。方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)---重復(fù)性試驗(yàn)當(dāng)前第8頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)是將同一材料分成數(shù)份實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，在盡可能短的時(shí)間內(nèi)平行測(cè)定20次；日內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)是將同一材料分成數(shù)份實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，在1天內(nèi)作5輪，每輪4次測(cè)定，獲得20個(gè)測(cè)定數(shù)據(jù)；日間重復(fù)性試驗(yàn)是將同一材料分成20份實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，每天測(cè)定1份，連測(cè)20天。分別作統(tǒng)計(jì)處理即可測(cè)得候選方法的批內(nèi)、日內(nèi)和日間的隨機(jī)誤差。方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)---重復(fù)性試驗(yàn)當(dāng)前第9頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)血清(漿)總蛋白(TP)測(cè)定血清總蛋白質(zhì)檢測(cè)有何臨床意義？血清總蛋白質(zhì)（totalprotein，TP）是血清中各種蛋白質(zhì)的總稱，是血漿固體成分中含量最多的一類物質(zhì)，具有維持血液正常膠體滲透壓和pH、運(yùn)輸多種代謝物、免疫、催化、營養(yǎng)作用等多種功能。90%以上的血清總蛋白由肝臟合成，如清蛋白、a1、a2、β球蛋白，纖維蛋白原等，當(dāng)肝臟發(fā)生病變時(shí)，肝細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的功能減退，血漿中蛋白質(zhì)即會(huì)發(fā)生質(zhì)和量的變化。臨床上用各種方法檢測(cè)血漿蛋白的含量來協(xié)助診斷肝臟疾患，并作為療效觀察，預(yù)后判斷的指標(biāo)。但由于肝功能有很大代償能力及清蛋白半衰期較長，因此肝臟病變往往達(dá)到一定程度和一定病程后才能出現(xiàn)血清總蛋白和清蛋白量的改變。當(dāng)前第10頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)血清(漿)總蛋白(TP)測(cè)定血清總蛋白質(zhì)檢測(cè)有何臨床意義？1．生理性升高：劇烈運(yùn)動(dòng)后。2．生理性降低：妊娠。3．病理性升高（相對(duì)少見）：(1)血清中水分減少，使總蛋白濃度相對(duì)增高。常見于急性失水引起血液濃縮(如嘔吐、腹瀉等)；休克時(shí)，毛細(xì)血管通透性發(fā)生變化，血漿濃縮；慢性腎上腺皮質(zhì)機(jī)能減退的病人，由于鈉的丟失繼發(fā)水分丟失，血漿也發(fā)生濃縮。(2)血清蛋白質(zhì)合成增加(主要是球蛋白的增加)?？偟鞍卓沙^100g／L，多見于多發(fā)性骨髓瘤病人。參考區(qū)間：65~85g/L當(dāng)前第11頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)血清(漿)總蛋白(TP)測(cè)定血清總蛋白質(zhì)檢測(cè)有何臨床意義？4．病理性降低：(1)血漿中水分增加，血漿被稀釋。因各種原因引起的水鈉潴留或輸注過多的低滲溶液。(2)營養(yǎng)不良或長期消耗性疾病。如嚴(yán)重結(jié)核病和惡性腫瘤等。(3)合成障礙。主要是肝臟功能嚴(yán)重?fù)p害時(shí)，蛋白質(zhì)的合成減少，以白蛋白的下降最為顯著。(4)蛋白質(zhì)丟失。大出血時(shí)大量血液丟失；腎病時(shí)尿液中長期丟失蛋白質(zhì)；嚴(yán)重?zé)齻麜r(shí)，大量血漿滲出等。當(dāng)前第12頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)重復(fù)的肽鏈結(jié)構(gòu)酪氨酸和色氨酸殘基對(duì)酚試劑反應(yīng)或紫外吸收與某些染料特異結(jié)合的能力采用沉淀反應(yīng)借助濁度或光折射原理測(cè)定電泳的遷移率大小血清(漿)總蛋白(TP)測(cè)定蛋白質(zhì)檢測(cè)方法當(dāng)前第13頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)凱式定氮法（N）雙縮脲法（肽鍵）酚試劑法（Lowry法）比濁法（沉淀）血清(漿)總蛋白(TP)測(cè)定蛋白質(zhì)檢測(cè)方法早期用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。該方法較雙縮脲法反應(yīng)靈敏100倍左右，檢測(cè)范圍最低可達(dá)5μg，通常為20~250μg，使用很廣泛，但花費(fèi)時(shí)間長（40~60分鐘），干擾因素較多(硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸，各種硫醇)，顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化，較適合單一蛋白質(zhì)測(cè)定。近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。（靈敏度好，費(fèi)時(shí)，操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí)）1883年建立，是經(jīng)典的蛋白質(zhì)測(cè)定方法。該法結(jié)果準(zhǔn)確，精密度高，靈敏度低，適用于0.2~1.0mg氮測(cè)定，是蛋白質(zhì)測(cè)定的參考方法，但由于操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)（8~10h），影響因素較少（主要為非蛋白氮，但可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離），不適用于常規(guī)測(cè)定，目前多用于蛋白質(zhì)的定值和校正其他方法。（測(cè)定準(zhǔn)確，干擾少，費(fèi)時(shí)太長）此法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，干擾物質(zhì)少(硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸)，在10~120g/L濃度范圍內(nèi)成良好的線形關(guān)系，批內(nèi)CV值＜2%。其缺點(diǎn)是靈敏度較低(1~20mg)，不同蛋白質(zhì)顯色相似，但能滿足臨床要求，是目前臨床測(cè)定蛋白質(zhì)的一種首選方法。此法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，缺點(diǎn)是影響因素較多。一般用于測(cè)定尿液、腦脊液等蛋白質(zhì)濃度較低的樣品。當(dāng)前第14頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)電泳法紫外分光光度法血清(漿)總蛋白(TP)測(cè)定蛋白質(zhì)檢測(cè)方法此法操作簡(jiǎn)便、快速（5~10分鐘），不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用，靈敏高，適用于50~100μg測(cè)定。但受蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量的影響，干擾因素也較多（各種嘌呤和嘧啶，各種核苷酸，可校正）。故適用于測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)，不適合血清等組成復(fù)雜的蛋白質(zhì)測(cè)定，特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)。主要有醋酸纖維素薄膜電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳，等電聚焦電泳、雙向電泳等。全自動(dòng)電泳儀在臨床的應(yīng)用也逐漸增多，條帶清晰，分辨效果好，能看到蛋白質(zhì)全貌，但耗時(shí)較長，需要特殊儀器。當(dāng)前第15頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)常用染料有氨基黑、麗春紅、考馬斯亮藍(lán)、鄰苯三酚紅鉬等。氨基黑、麗春紅常作為血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳或瓊脂糖凝膠電泳的染料?？捡R斯亮藍(lán)(Bradford)1976年由Bradford建立，該法靈敏度最高（1~5μg），試劑配制簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快（5~15分鐘）、簡(jiǎn)便，，干擾因素少(強(qiáng)堿性緩沖液；TritonX100；SDS)，顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化。適用于要求靈敏度高的微量蛋白質(zhì)快速定量測(cè)定，如尿液、腦脊液等。但有染料粘附比色杯上不易洗脫的缺點(diǎn)。血清(漿)總蛋白(TP)測(cè)定蛋白質(zhì)檢測(cè)方法當(dāng)前第16頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)鄰苯三酚紅鉬也可用于測(cè)定尿液、腦脊液蛋白質(zhì)含量，既不粘附比色杯,又具有高靈敏度，已有用于自動(dòng)化分析測(cè)定尿液蛋白質(zhì)的試劑盒。還有測(cè)定Alb常用的染料甲基橙、溴甲酚紫(BCP)、溴甲酚綠（BCG）等，目前應(yīng)用最廣的是BCG。此法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，重復(fù)性好，適合自動(dòng)分析；且球蛋白一般與陰離子染料不結(jié)合，無干擾作用。是清蛋白測(cè)定的常規(guī)方法，應(yīng)用最廣。血清(漿)總蛋白(TP)測(cè)定蛋白質(zhì)檢測(cè)方法當(dāng)前第17頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)利用抗原抗體特異反應(yīng)免疫比濁法、免疫擴(kuò)散法、免疫沉淀法、免疫化學(xué)法等血清(漿)總蛋白(TP)測(cè)定蛋白質(zhì)檢測(cè)方法當(dāng)前第18頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下，與Cu2+產(chǎn)生穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物。與兩分子尿素縮合后生成的雙縮脲在堿性溶液中與Cu2+的反應(yīng)相似，故稱為雙縮脲反應(yīng)。絡(luò)合物顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)的濃度成正比（與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)），與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比較，經(jīng)計(jì)算即可求出血清總蛋白質(zhì)含量。方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)---重復(fù)性試驗(yàn)當(dāng)前第19頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)1.樣本：收集無溶血、無脂濁、無傳染性疾病、肝腎功能正常的人混合血清。方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)---重復(fù)性試驗(yàn)2．雙縮脲試劑3．蛋白標(biāo)準(zhǔn)液4．自動(dòng)生化分析儀或722型分光光度計(jì)，刻度吸管，試管，試管架，微量加樣器，恒溫水浴箱等硫酸銅2.0mmol/L酒石酸鉀鈉31.9mmol/L碘化鉀30.1mmol/L氫氧化鈉600mmol/L酒石酸鉀鈉可以與Cu2+形成絡(luò)合物，并維持Cu2+在堿性溶液中的穩(wěn)定性，避免形成Cu(OH)2沉淀使試劑失效。碘化鉀是抗氧化劑，防止Cu2+還原，從而延長試劑的使用壽命。氫氧化鉀僅僅是為了提供堿性環(huán)境，因此它可被其他堿，如氫氧化鈉所代替。當(dāng)前第20頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)血清(漿)總蛋白(TP)測(cè)定加入物空白管（B）標(biāo)準(zhǔn)管（S）測(cè)定管（U1~20）蒸餾水（μl）20——蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（μl）—20—待測(cè)血清（μl）——20雙縮脲試劑(ml)1.01.01.0混勻，置37℃水浴10min，以空白管調(diào)零，用540nm波長比色，讀取各管吸光度值(A值)并計(jì)算。將以上收集的樣本分為20份并進(jìn)行編號(hào)，按下表操作：當(dāng)前第21頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)---重復(fù)性試驗(yàn)1.根據(jù)以下公式求出各個(gè)測(cè)定管（U1~20）的血清總蛋白的濃度：當(dāng)前第22頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)2.根據(jù)以下公式求出均值和標(biāo)準(zhǔn)差s：表示各測(cè)定值總和；i=1表示從第1個(gè)樣本值開始加，加到第n個(gè)x值，本實(shí)驗(yàn)共20個(gè)測(cè)定值。方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)---重復(fù)性試驗(yàn)當(dāng)前第23頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)3.離群值檢驗(yàn)用求得的均值和標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)20個(gè)測(cè)定值進(jìn)行檢驗(yàn)，如果其中有一個(gè)數(shù)據(jù)超過X±3S時(shí)，該數(shù)據(jù)為離群值。剔除該數(shù)據(jù)后補(bǔ)做一個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后重新計(jì)算X和s。有兩個(gè)以上離群值時(shí)，重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本次實(shí)驗(yàn)作廢。4.計(jì)算CV。方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)---重復(fù)性試驗(yàn)當(dāng)前第24頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)5.如試驗(yàn)求得的血清TP雙縮脲試劑法的CV值＜WHO對(duì)中等實(shí)驗(yàn)室提出的OCV(±3%)標(biāo)準(zhǔn)，即表明實(shí)驗(yàn)條件的控制達(dá)到最佳條件，試驗(yàn)結(jié)果可按OCV%報(bào)告。作為方法探討實(shí)驗(yàn)，其變異系數(shù)應(yīng)該＜OCV標(biāo)準(zhǔn)。方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)---重復(fù)性試驗(yàn)當(dāng)前第25頁\共有29頁\編于星期三\6點(diǎn)6.變異指數(shù)得分（VIS）方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)---重復(fù)性試驗(yàn)VI＝V×100／CCVV為變異百分?jǐn)?shù)，X為各室測(cè)定結(jié)果，X為各實(shí)驗(yàn)室結(jié)果均值（剔除X+3S以外的結(jié)果）,T為靶值,VI為變異指數(shù)，CCV為選定的變異系數(shù)。