基因工程原理PrincipleofGeneEngineering第三章基因工程原理當前第1頁\共有84頁\編于星期五\7點DNA重組（限制性內(nèi)切酶）運輸工具——基因克隆載體目的基因的制備目的基因?qū)胧荏w細胞外源基因的表達基因工程的應(yīng)用當前第2頁\共有84頁\編于星期五\7點第三章基因克隆載體克隆載體：一種具有特定功能的DNA分子，他們將攜帶外源DNA片段或基因進入受體細胞，并使其在特定受體細胞中得以維持或表達。原核生物克隆載體真核生物克隆載體穿梭載體：是指含有兩個親緣關(guān)系不同的復制子，能在兩種不同的生物中復制的。例如既能在原核生物中復制，又能在真核生物中復制的載體。當前第3頁\共有84頁\編于星期五\7點針對受體細胞的可轉(zhuǎn)移性自主復制功能：ori顯著的篩選標記：抗藥性或顯色特定的多克隆位點：RE位點安全性：不含對受體有害基因、不任意轉(zhuǎn)入其它細胞尤其是人體細胞第一節(jié)克隆載體的一般特征當前第4頁\共有84頁\編于星期五\7點一、細菌質(zhì)粒載體第二節(jié)原核生物基因克隆載體——細菌質(zhì)粒載體是以細菌質(zhì)粒DNA分子為基礎(chǔ)構(gòu)建的克隆載體，主要用于外源基因片段的轉(zhuǎn)移、貯存、表達以及基因文庫的構(gòu)建等。當前第5頁\共有84頁\編于星期五\7點——宿主細胞染色體外裸露的雙鏈DNA分子。（一）質(zhì)粒（Plasmid）組成與構(gòu)型1.質(zhì)粒構(gòu)型：共價閉合環(huán)型DNA（ccc-DNA）呈超螺旋SC構(gòu)型開環(huán)DNA（oc-DNA）線性DNA（L-DNA）當前第6頁\共有84頁\編于星期五\7點ccc-DNAl-DNAoc-DNA當前第7頁\共有84頁\編于星期五\7點2.質(zhì)粒DNA分子大小當前第8頁\共有84頁\編于星期五\7點3.質(zhì)粒的復制——嚴緊型質(zhì)粒：1個寄主內(nèi)僅含1-3拷貝——松弛型質(zhì)粒：1個寄主內(nèi)含10-60拷貝當前第9頁\共有84頁\編于星期五\7點質(zhì)粒DNA復制：單向復制，受宿主細胞和質(zhì)粒遺傳系統(tǒng)雙重控制，不會無限制復制。質(zhì)粒DNA復制控制機理的分子模型：自體阻遏蛋白質(zhì)模型（autorepressormodel）抑制蛋白質(zhì)稀釋模型（inhibitordilutionmodel）質(zhì)?？刂疲篛ri序列拷貝數(shù)：細胞內(nèi)某種質(zhì)粒的數(shù)量與染色體的數(shù)量之比。當前第10頁\共有84頁\編于星期五\7點自體阻遏蛋白質(zhì)模型：質(zhì)粒DNA復制控制機理有兩種解釋解釋一：質(zhì)粒DNA的復制是由一種叫做起始蛋白質(zhì)Rep引發(fā)的。Rep蛋白質(zhì)編碼基因rep和自體阻遏蛋白質(zhì)編碼基因atr是屬于同一個操縱子，它們共轉(zhuǎn)錄成同一個mRNA分子。自體阻遏蛋白質(zhì)通過同啟動子-操縱基因區(qū)（P/O）的結(jié)合作用，調(diào)節(jié)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)錄作用，以維持細胞中Atr和Rep蛋白質(zhì)處于恒定的水平。而后，由Atr蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)產(chǎn)生的Rep蛋白質(zhì)，則是通過同復制起點（ori）的結(jié)合，來引發(fā)質(zhì)粒DNA的復制[圖（a）]。當前第11頁\共有84頁\編于星期五\7點自體阻遏蛋白質(zhì)模型：解釋二：Rep蛋白質(zhì)是一種具有雙重功能的蛋白質(zhì)。它既具有自體阻遏蛋白質(zhì)的功能，可同P/O區(qū)結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄作用；同時又具有起始蛋白質(zhì)的功能，能對復制起點（ori）發(fā)生作用，引發(fā)質(zhì)粒DNA進行復制[圖（b）]當前第12頁\共有84頁\編于星期五\7點抑制蛋白質(zhì)稀釋模型：質(zhì)粒DNA的復制，是受一種由質(zhì)粒DNA編碼的抑制蛋白質(zhì)Cop調(diào)控的。細胞中Cop蛋白質(zhì)的濃度是同質(zhì)粒分子的拷貝數(shù)成正比。Cop抑制質(zhì)粒DNA復制活性的作用方式有兩種途徑：通過同質(zhì)粒DNA的復制起點（ori）結(jié)合，直接地抑制質(zhì)粒DNA的復制。通過阻斷起始蛋白質(zhì)Rep的合成，間接地抑制質(zhì)粒DNA的合成。當前第13頁\共有84頁\編于星期五\7點——在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能在同一宿主細胞中穩(wěn)定地共存，這一現(xiàn)象叫質(zhì)粒不親和性。隨著細胞分裂質(zhì)粒分配到子細胞質(zhì)?？截悢?shù)加倍兩種不相容質(zhì)粒的拷貝數(shù)變化4.質(zhì)粒的不親和性當前第14頁\共有84頁\編于星期五\7點野生型與其衍生物通常屬于不親和質(zhì)粒，因此，受體細胞最好不含內(nèi)源質(zhì)粒當前第15頁\共有84頁\編于星期五\7點接合型質(zhì)粒：含有tra基因的質(zhì)粒。F質(zhì)粒非接合型質(zhì)粒：不含tra基因的質(zhì)粒。ColE15.質(zhì)粒遷移——轉(zhuǎn)移性質(zhì)?？稍诩毎g轉(zhuǎn)移，并能帶動染色體發(fā)生轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。構(gòu)建克隆載體的一般是非接合型質(zhì)粒當前第16頁\共有84頁\編于星期五\7點顯性質(zhì)粒：能使宿主細胞表現(xiàn)出質(zhì)粒所攜帶的性狀。如：隱蔽質(zhì)粒：不會賦予宿主細胞新性狀的質(zhì)粒為隱性質(zhì)粒。6.顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)?？剐再|(zhì)粒（R質(zhì)粒），抗Amp（Ap)、抗Cmp（Cm)、抗Kan（Km)、抗Tet（Tc)等育性質(zhì)粒（F質(zhì)粒）降解質(zhì)粒：降解農(nóng)藥Ti質(zhì)粒：形成冠癭瘤當前第17頁\共有84頁\編于星期五\7點（二）構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的策略含有有效的質(zhì)粒復制起始位點（ori）含有外源DNA片段克隆位點含有標記基因載體DNA分子盡可能小特殊需要的元件：強啟動子、終止子…當前第18頁\共有84頁\編于星期五\7點（三）質(zhì)粒載體的構(gòu)建選擇合適的出發(fā)質(zhì)粒：ori，選擇標記、克隆位點、啟動子、終止子……正確獲得構(gòu)建質(zhì)粒載體的元件組裝合適的選擇標記基因選用合適的啟動子構(gòu)建過程簡單1.質(zhì)粒載體的構(gòu)建原則當前第19頁\共有84頁\編于星期五\7點pBR322質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特征：大?。?363bp具有ColE1拷貝復制子選擇標記：Amp，Tet24種限制性核酸內(nèi)切酶單一位點

BamHI等導致Tet插入失活

PstI等導致Amp插入失活可以克隆10kb以下外源DNA片段2.大腸桿菌質(zhì)?？寺≥d體pBR322當前第20頁\共有84頁\編于星期五\7點啟動子區(qū)當前第21頁\共有84頁\編于星期五\7點啟動子：Promotor，DNA分子上能與RNA聚合酶結(jié)合并形成轉(zhuǎn)錄起始復合體的區(qū)域，在許多情況下，還包括促進這一過程的調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點。當前第22頁\共有84頁\編于星期五\7點Pribnowbox5’-AGGAGG-3’SD序列當前第23頁\共有84頁\編于星期五\7點pBR322質(zhì)?？寺≥d體構(gòu)建：當前第24頁\共有84頁\編于星期五\7點pBR322質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)來源優(yōu)點：分子量小2個選擇標記及若干個插入失活位點高拷貝數(shù)Apr缺點：負篩選當前第25頁\共有84頁\編于星期五\7點①pUC質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)特點pBR322的復制起點Amp標記大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因LacZ的啟動子、調(diào)節(jié)因子及編碼α-肽鏈的DNA序列——LacZ’在LacZ’的5‘端有1段多克隆位點（MCS）區(qū)段。3.質(zhì)粒克隆載體pUC18/19當前第26頁\共有84頁\編于星期五\7點當前第27頁\共有84頁\編于星期五\7點當前第28頁\共有84頁\編于星期五\7點pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點——具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)pUC18/19的分子量2.69kb——具有多克隆位點：多種粘性末端的切點——篩選方便：藍/白菌落當前第29頁\共有84頁\編于星期五\7點當前第30頁\共有84頁\編于星期五\7點pBR322質(zhì)粒是人工構(gòu)建的一種較為理想的大腸桿菌質(zhì)粒載體，分子大小為（4.3kb），具有松弛型復制子，選擇標記為（Amp）和（Tet）。就克隆一個基因(DNA片段)來說，最簡單的質(zhì)粒載體也必需包括三個部分：（復制區(qū)：含有復制起點）；（選擇標記：主要是抗性基因）；（克隆位點：便于外源DNA的插入）。另外，一個理想的質(zhì)粒載體必須具有低分子量。載體的功能是（d）（a）外源基因進入受體的搭載工具（b）不能為外源基因提供整合能力（c）不能提供復制能力（d）不能為外源基因提供表達能力基因工程中所用的質(zhì)粒載體大多是改造過的，真正的天然質(zhì)粒載體很少，在下列載體中只有（a）被視為用作基因工程載體的天然質(zhì)粒載體（a）pSCl01（b）pBR322（c）pUBll0（d）pUCl8當前第31頁\共有84頁\編于星期五\7點第七次課結(jié)束！當前第32頁\共有84頁\編于星期五\7點4.TA載體TTAA當前第33頁\共有84頁\編于星期五\7點當前第34頁\共有84頁\編于星期五\7點5.質(zhì)粒表達載體——表達載體是在克隆載體的基礎(chǔ)上增加了表達元件構(gòu)建而成的，在受體細胞內(nèi)能穩(wěn)定維持并表達外源目的基因。當前第35頁\共有84頁\編于星期五\7點lac啟動子表達系統(tǒng)當前第36頁\共有84頁\編于星期五\7點質(zhì)粒表達載體融合型表達載體非融合型表達載體分泌型表達載體當前第37頁\共有84頁\編于星期五\7點融合蛋白質(zhì)克隆載體克隆外源基因示意圖融合蛋白表達載體：融合蛋白：由克隆在一起的兩個或數(shù)個不同基因的編碼序列組成的融合基因轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的單一的多肽序列。當前第38頁\共有84頁\編于星期五\7點表達融合體蛋白質(zhì)策略的優(yōu)點：（1）克隆的外源基因能有效轉(zhuǎn)譯。（2）表達的蛋白質(zhì)穩(wěn)定。（3）可以加入信號肽，定位輸送蛋白質(zhì)。（4）利于分離純化。當前第39頁\共有84頁\編于星期五\7點非融合蛋白表達載體：當前第40頁\共有84頁\編于星期五\7點二、噬菌體克隆載體λDNA：——在噬菌體中是線狀DNA分子，進入寄主細胞后呈環(huán)狀DNA分子?！L48kb。——左右兩端各有12bp組成的彼此完全互補的粘性末端。形成cos位點?！?1個基因，其中1/2參與了噬菌體生命周期，是必要基因，另1/2屬于不必要基因，用于基因工程操作。當前第41頁\共有84頁\編于星期五\7點相關(guān)概念：溶菌生命周期：噬菌體吸附到寄主細胞表面后，注入DNA進行復制及蛋白質(zhì)合成，并組裝成子代噬菌體顆粒后，使寄主細胞破裂，釋放出來的過程。溶原生命周期：在感染過程中沒有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，噬菌體DNA整合到寄主細胞染色體上，隨著染色體的復制而復制的過程。溫和噬菌體：能進入溶原周期和溶菌周期的噬菌體。烈性噬菌體：具有溶菌生命周期的噬菌體。溶原性細菌：帶有溫和噬菌體的細菌。當前第42頁\共有84頁\編于星期五\7點溶原性噬菌體的生命周期a：噬菌體吸附到寄主細胞表面；b：噬菌體DNA注入寄主細胞；c：噬菌體大量增殖d：子代噬菌體顆粒組裝；e：寄主細胞溶菌；f：噬菌體DNA從寄主染色體DNA上刪除下來；g：溶原性細胞按照正常速率分裂。當前第43頁\共有84頁\編于星期五\7點1.與構(gòu)建載體相關(guān)的λ噬菌體性質(zhì)基因按功能相近性聚集成簇：左側(cè)區(qū)：A-J，合成頭尾蛋白的全部基因中間區(qū)：J-N，非必要區(qū)，與重組有關(guān)右側(cè)區(qū)：N-R，DNA合成及調(diào)控。當前第44頁\共有84頁\編于星期五\7點G+C=10A+T=2cos位點：cohesive-endsite粘性末端位點線性雙鏈DNA分子兩端各有1條由12個核苷酸組成的完全互補的5'單鏈突出序列，即粘性末端。注入到寄主細胞內(nèi)的線性DNA分子會迅速的通過粘性末端之間的互補作用，形成環(huán)狀雙鏈DNA分子。然后在DNA連接酶的作用下，將相鄰的5'—P和3'—OH基團封閉起來，進一步超盤旋化，這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈DNA區(qū)域稱為cos位點。當前第45頁\共有84頁\編于星期五\7點2.λ噬菌體作為構(gòu)建克隆載體的依據(jù)λ噬菌體是一種溫和噬菌體能承載比較大的外源DNA片段存在多個限制性位點當前第46頁\共有84頁\編于星期五\7點3.構(gòu)建λ噬菌體克隆載體的基本策略和路線用限制酶切去λDNA上的非必需區(qū)在λDNA的非必需區(qū)內(nèi)組入選擇性標構(gòu)建重組λDNA分子體外包裝系統(tǒng)當前第47頁\共有84頁\編于星期五\7點噬菌體的包裝：當前第48頁\共有84頁\編于星期五\7點體外包裝：在離體條件下，用噬菌體或病毒的蛋白質(zhì)包裹噬菌體或病毒的裸核酸，組裝成有感染性的噬菌體或病毒顆粒的過程。當前第49頁\共有84頁\編于星期五\7點λDNA分子體外包裝系統(tǒng)的建立E基因：λ噬菌體的E基因編碼頭部基因的主要成分（占頭部總蛋白的70%）D基因：λ噬菌體的D基因也編碼頭部蛋白，但主要與λDNA進入頭部和頭部的成熟有關(guān)（占20%）當前第50頁\共有84頁\編于星期五\7點當前第51頁\共有84頁\編于星期五\7點當前第52頁\共有84頁\編于星期五\7點4.λ噬菌體DNA的包裝限制問題包裝能力：λDNA×75%——λDNA×105%，即從36kb——51kb野生型λDNA的必要區(qū)是28kb，所以能加入的外源DNA長度最大為51kb-28kb=23kb。實際為15kb。若λ基因組缺失大于25%時，也不能有效包裝。當前第53頁\共有84頁\編于星期五\7點轉(zhuǎn)染作用（transfection）：寄主細胞捕獲噬菌體DNA的過程。或重組噬菌體DNA分子感染并進入大腸桿菌的過程。轉(zhuǎn)導作用（transduction）：以噬菌體顆粒為媒介轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的過程。轉(zhuǎn)化作用（transformation）：將質(zhì)粒等外源DNA引入細胞的過程。5.λ噬菌體克隆載體的應(yīng)用——構(gòu)建cDNA文庫細菌質(zhì)粒載體：是以細菌質(zhì)粒DNA分子為基礎(chǔ)構(gòu)建的克隆載體，主要用于外源基因片段的轉(zhuǎn)移、貯存、表達以及基因文庫的構(gòu)建等。當前第54頁\共有84頁\編于星期五\7點三、Cosmid載體（cossite-carryingplasmid）（一）Cosmid載體的特征環(huán)形雙鏈DNA分子，大小一般在10kb以下具有質(zhì)粒的性質(zhì)含有一個cos位點：cohesive-endsite粘性末端位點能承載較大的外源DNA片段——一類由人工構(gòu)建的含有λDNA的cos序列和質(zhì)粒復制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。當前第55頁\共有84頁\編于星期五\7點

克隆能力：31—45kbpBR322（6524bp)λDNA：cos序列和控制包裝序列pBR322質(zhì)粒的復制子抗藥性基因多克隆位點區(qū)當前第56頁\共有84頁\編于星期五\7點（二）Cosmid載體的應(yīng)用程序應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體，在大腸桿菌細胞中克隆大片段的真核基因組DNA技術(shù)，叫做柯斯克?。╟osmidcloning）?？寺∵M柯斯載體包裝進噬菌體感染大腸桿菌選擇轉(zhuǎn)化子當前第57頁\共有84頁\編于星期五\7點進行λDNA體外包裝時，選擇E基因突變的λ噬菌體，能夠使溶菌物中積累了大量的（尾部蛋白），而利用D基因突變的λ噬菌體，產(chǎn)生大量的（頭部蛋白），把這兩種溶菌物和重組DNA混合起來，將重組λDNA包裝起來。 重組在λ噬菌體載體上的DNA分子轉(zhuǎn)導大腸桿菌的過程包括：制備包裝物，然后進行（體外包裝），侵染（大腸桿菌），并篩選（重組體）噬菌斑。柯斯質(zhì)粒(cosmid)是質(zhì)?！删w雜合載體，它的復制子來自（質(zhì)粒）、COS位點序列來自（噬菌體），最大的克隆片段達到（45）kb。噬菌體載體由于受到包裝的限制，插入外源DNA片段后，總的長度應(yīng)在噬菌體基因組的（75％～105％）的范圍內(nèi)。下列哪種克隆載體對外源DNA的容載量最大？（b）（a）質(zhì)粒（b）cosmid（c）λ噬菌體載體（d）cDNA表達載體（e）pUC質(zhì)粒當前第58頁\共有84頁\編于星期五\7點第八次課結(jié)束！當前第59頁\共有84頁\編于星期五\7點四、藍藻基因克隆載體（一）藍藻質(zhì)粒表達載體pPEK2的構(gòu)建出發(fā)質(zhì)粒：藍藻pPbS和pBR322當前第60頁\共有84頁\編于星期五\7點（二）藍藻染色體定位整合載體的構(gòu)建當前第61頁\共有84頁\編于星期五\7點第三節(jié)酵母基因克隆載體1.2μm質(zhì)粒當前第62頁\共有84頁\編于星期五\7點當前第63頁\共有84頁\編于星期五\7點2.YEp24（酵母游離型質(zhì)粒）載體出發(fā)質(zhì)粒：酵母2mm質(zhì)粒和pBR322當前第64頁\共有84頁\編于星期五\7點ura3基因：尿嘧啶合成缺陷型基因酵母V號染色體上的一個基因，系統(tǒng)命名號為YEL021W，編碼乳清苷5-磷酸脫羧酶，是酵母RNA嘧啶核苷酸合成過程中關(guān)鍵酶。應(yīng)用方式：（2）陰性選擇：乳清苷5-磷酸脫羧酶正常（1）陽性選擇：乳清苷5-磷酸脫羧酶缺陷轉(zhuǎn)入ura3基因，培養(yǎng)基中加入尿苷或尿嘧啶，缺陷株生長。5-氟乳清酸5-氟尿嘧啶，乳清苷5-磷酸脫羧酶細胞死亡當前第65頁\共有84頁\編于星期五\7點Ti質(zhì)粒（Tumorinducingplasmid）——存在于植物的土壤致癌農(nóng)桿菌中，誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤的質(zhì)粒。分為4種類型：一、農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體章魚堿型胭脂堿型琥珀堿型農(nóng)桿堿型第四節(jié)植物基因克隆載體（一）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒當前第66頁\共有84頁\編于星期五\7點Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體以外的遺傳物質(zhì)雙鏈閉合環(huán)型DNA200-250kb結(jié)構(gòu)分為4個功能區(qū)：

（Vir區(qū)）（Con區(qū)）T-DNA區(qū)Vir區(qū)Con區(qū)Ori區(qū)當前第67頁\共有84頁\編于星期五\7點（Vir區(qū)）（Con區(qū)）長度25kb，占Ti質(zhì)粒1/10主要功能是轉(zhuǎn)移DNA，隨機插入植物染色體中?！烊坏馁|(zhì)?？寺≥d體。含有2類基因：（1）編碼冠癭堿合成酶（ocs、nos）及分解代謝的基因。（2）誘發(fā)腫瘤基因（Onc）Vir區(qū)：激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性。占Ti質(zhì)粒1/3。Con區(qū)——調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移，含有與細菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因tra。Ori區(qū)——復制起始區(qū)。當前第68頁\共有84頁\編于星期五\7點（二）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建取代型Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)建當前第69頁\共有84頁\編于星期五\7點第五節(jié)動物基因克隆載體一、SV40克隆載體二、逆轉(zhuǎn)錄病毒基因載體三、腺病毒基因載體四、豆苗病毒基因載體五、桿狀病毒表達載體當前第70頁\共有84頁\編于星期五\7點SV40克隆載體：猿猴空泡病毒405243bp當前第71頁\共有84頁\編于星期五\7點一、酵母人工染色體（YAC）的構(gòu)建第六節(jié)人工染色體載體利用酵母著絲粒載體所構(gòu)建的大片段DNA克隆?？寺≥d體上含有著絲粒、端粒、可選擇標志基因、自主復制等序列，可攜帶插入的大片段DNA(100～1000kb)在酵母細胞中有效地復制，如同微小的人工染色體。是基因組研究的有用工具。當前第72頁\共有84頁\編于星期五\7點TEL：酵母染色體DNA端粒ARS：DNA復制起點CEN：著絲粒應(yīng)用：構(gòu)建人類和高等生物的基因組文庫選擇標記his3：組氨酸合成缺陷型基因Trp1：色氨酸合成缺陷型基因ura3：尿嘧啶合成缺陷型基因sup4：赭石突變抑制基因第二受體克隆子篩選標記第一受體克隆子篩選標記：抗生素當前第73頁\共有84頁\編于星期五\7點某一突變基因的表型效應(yīng)由于第二個突變基因的出現(xiàn)而恢復正常時,稱后一突變基因為前者的抑制基因?；貜屯蛔兪雇蛔兓虻拿撗鹾颂呛怂?DNA)分子結(jié)構(gòu)恢復正常；抑制基因則并不改變突變基因的DNA分子結(jié)構(gòu),而只是使突變型的表型恢復正常。抑制基因一般用符號Su代表。無義抑制基因的種類：琥珀型抑制基因：UAG赭石型抑制基因：UAA乳白型抑制基因：UGA、UAG當前第74頁\共有84頁\編于星期五\7點酵母人工染色體（YAC）的應(yīng)用酵母人工染色體（YAC）的局限性構(gòu)建基因組文庫存在插入子的穩(wěn)定性問題。同一酵母細胞內(nèi)多個YAC引起交換轉(zhuǎn)化效率低。難以制備純的YAC-DNA（因結(jié)合組蛋白）。當前第75頁\共有84頁\編于星期五\7點二、細菌人工染色體載體（BAC）利用大腸桿菌F質(zhì)?；騊1噬菌體為基礎(chǔ)構(gòu)建的用于在大腸桿菌中克隆大片段DNA(100～350kb)的載體。用于基因組結(jié)構(gòu)的分析。當前第76頁\共有84頁\編于星期五\7點特點：

帶有外源DNA的BAC載體在細胞中是單拷貝的；

載體分子量很小(7.4kb)；

選擇標記：氯霉素抗性基因；

多克隆位點。當前第77頁\共有84頁\編于星期五\7點BAC的優(yōu)點：BAC的優(yōu)點：1.BAC復制子來源于F因子：穩(wěn)定性好2.宿主為大腸桿菌3.體外操作簡單4.容易構(gòu)建5.篩選方便6.克隆位點兩側(cè)含有T7和Sp6聚合酶啟動子，可用