外顯子捕獲

余晗

20171201

當(dāng)前第1頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)外顯子是真核生物基因的一部分，它在剪接后仍會(huì)被保存下來，并可在蛋白質(zhì)生物合成過程中被表達(dá)為蛋白質(zhì)。在人類基因中大約有180,000個(gè)外顯子，占人類基因組的1%，約30MB。人類基因組的蛋白編碼區(qū)域大約包含85%的致病突變。

外顯子測(cè)序是指利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的基因組分析方法。是一種選擇基因組的編碼序列的高效策略，外顯子測(cè)序相對(duì)于基因組重測(cè)序成本較低，對(duì)研究已知基因的SNP、Indel等具有較大的優(yōu)勢(shì)。

對(duì)腫瘤基因突變檢測(cè)具有顯著意義，因?yàn)橥怙@子測(cè)序容易提高深度，可以輕易達(dá)到100X、200X。而因?yàn)橥怙@子捕獲是有偶然性的，對(duì)小片段結(jié)構(gòu)變異、拷貝數(shù)變異很難檢測(cè)。外顯子測(cè)序簡(jiǎn)介當(dāng)前第2頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)外顯子組包含合成蛋白質(zhì)所需要的重要信息序列。外顯子序列捕獲芯片（或溶液）可在同一張芯片上以高特異性和高覆蓋率捕獲研究者感興趣的目標(biāo)外顯子區(qū)域，后續(xù)測(cè)序直接解析數(shù)據(jù)。

背景介紹當(dāng)前第3頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)發(fā)現(xiàn)外顯子區(qū)的絕大部分的疾病相關(guān)變異可發(fā)現(xiàn)常見變異和頻率<5%低頻突變只對(duì)基因組的約1%測(cè)序，更加經(jīng)濟(jì)、高效人的全基因是3G，如果要把全基因都測(cè)一下，一般要平均30x的覆蓋。也就是要90G的數(shù)據(jù)。這樣的測(cè)序量，成本大約是一個(gè)樣本6萬多元。如果樣本多的話，費(fèi)用上可能負(fù)擔(dān)不起。

而外顯子只占人全部基因序列的1%，而且是最關(guān)鍵的1%。把外顯子全都測(cè)了，就相當(dāng)于抓住了問題的主要矛盾。同時(shí)測(cè)序量大大降低。這就是用外顯子測(cè)序來替代全基因重測(cè)序的第一個(gè)原因。在相同預(yù)算情況下，可提供更高深度測(cè)序第二個(gè)原因是在做腫瘤測(cè)序的時(shí)候，腫瘤本身存在著較大異質(zhì)性。腫瘤的基因序列是不穩(wěn)定的，一直在變的，也就是腫瘤的深部、淺部可能其基因序是不一樣的。為了測(cè)出各種突變，就需要有較深的測(cè)序重度，比如100x、甚至200x的測(cè)序深度。這時(shí)候外顯子測(cè)序就可以做到高的測(cè)序覆蓋度，同時(shí)費(fèi)用不會(huì)太高。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)當(dāng)前第4頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)劣勢(shì)：外顯子測(cè)序是全基因重測(cè)序的一個(gè)較為經(jīng)濟(jì)的替代手段，對(duì)研究基因的SNP、Indel等具有較大的優(yōu)勢(shì)，但無法

研究基因組結(jié)構(gòu)變異如染色體斷裂重組等，一般在疾病研究中，會(huì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序一起研究。當(dāng)前第5頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)目前市場(chǎng)主要外顯子捕獲試劑盒SeqCapEZHumanExomeLibraryv3.0（Roche）SureSelectXTHumanAllExonV6（Agilent）TruSeq

Exome

Library

Prep

Kit

（Illumina）TruSeq

RapidExome

Library

Prep

Kit（Illumina）當(dāng)前第6頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)四種測(cè)序試劑盒比較Nimblegen和Illumina的捕獲試劑盒中的探針是DNA探針，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)；Agilent的捕獲試劑盒是RNA探針，有可能RNA不是很穩(wěn)定。當(dāng)前第7頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)

Roche

羅氏2008年推出NimbleGen序列捕獲2.1M外顯子組芯片，隨之在2009年底推出的EZ外顯子組序列捕獲能提供液相的工作流程并以DNA液相探針雜交來捕獲目的片段。

SeqCapEZHumanExomeLibrary使用高密度探針的方法，主要是利用雜交和DNA微陣列技術(shù)基因分離原理來捕獲目標(biāo)區(qū)域。產(chǎn)物可以覆蓋20000個(gè)以上的基因，超過二百萬個(gè)DNA寡核苷酸探針捕獲目標(biāo)區(qū)域，覆蓋區(qū)域的總大小可以達(dá)到64Mb，編碼區(qū)覆蓋度達(dá)到97%以上，而且檢測(cè)靈敏度較高。

當(dāng)前第8頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)

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當(dāng)前第10頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)

當(dāng)前第11頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)LibraryPrepKitPureCaptureBeadKitAdapterKit(Aand/orB)pcrReadyMixHybridizationandWashKitDNACovaris打斷儀DNA真空濃縮儀金屬浴片段大小：180－220bp測(cè)序平臺(tái)：IlluminaGenomeAnalyzerII、HiSeq或MiSeq測(cè)序儀實(shí)驗(yàn)周期：2天

Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)當(dāng)前第12頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)1.雜交（47℃，16-20h）注意事項(xiàng)：

Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)16到20當(dāng)前第13頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)cot1-DNA

Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)當(dāng)前第14頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)

Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)當(dāng)前第15頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)

Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)當(dāng)前第16頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)

外顯子捕獲效率是什么？外顯子測(cè)序過程中要用到雜交過程。在人的染色體上有許多與外顯子有同源性的部分，這些有同源性的部分很可能在雜交過程中也被捕獲下來。所以，測(cè)到的序列中，有一部分不是外顯子序列。我們把測(cè)序得是外顯子的部分占全部測(cè)序序列的比列稱為捕獲效率。

Nimblegen大約是70%Agilent大約是60%Illumina大約是50%

Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)當(dāng)前第17頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)2.磁珠捕獲及洗脫

洗脫試劑配制--洗捕獲磁珠--孵育捕獲--洗脫非目標(biāo)核酸

Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)當(dāng)前第18頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)3.pcr擴(kuò)增9-11

Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)當(dāng)前第19頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)Thanks！當(dāng)前第20頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)

AgilentSureSelectXTHumanAllExonV6當(dāng)前第21頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)1SureSelectLibraryPrepKit.2SureSelectTargetEnrichmentKitIndexingHybModuleBox#23HerculaseIIFusionDNAPolymerase4SureSelectTargetEnrichmentKitBox#1片段大?。?50-200bp測(cè)序平臺(tái)：IlluminaHiSeq、MiSeq

實(shí)驗(yàn)周期：2天當(dāng)前第22頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)

illuminaIllumina,TruSeqExomeEnrichmentKit是近年來剛推出的一種溶液型的序列捕獲方法，利用雜交選擇分離出人類基因組中的目的外顯子區(qū)域。通過與目標(biāo)區(qū)域特異的生物素標(biāo)記DNA探針雜交，富集目標(biāo)區(qū)域，富集的DNA片段隨后從磁珠上洗脫，并雜交進(jìn)行第二次富集反應(yīng)，從而提高目的片段捕獲的特異性。

而且較其他產(chǎn)品，illumina外顯子捕獲試劑盒價(jià)格更低。當(dāng)前第23頁\共有27頁\編于星期四\16點(diǎn)TruSeq

Exome

Library

Prep

Kit當(dāng)前第24頁\共有27頁\