生物工程下游技術(shù)微生物細(xì)胞破碎第一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日酶來源應(yīng)用范圍L-天冬酰氨酶EruiniaCaratovoraEscherichiaColi治療急性淋巴癌過氧化氫酶Aspergillusniger牛奶滅菌后H2O2的清除膽固醇氧化酶Nocardiahodochrous膽固醇漿液分析β-半乳糖苷酶KluyveromycesfragilisSaccharomyceslactis在牛奶/乳清中乳糖的水解作用葡萄糖氧化酶AspergillusnigerPenicilluimnotatum葡萄糖漿液分析食品中氧的清除葡萄糖-6-磷酸脫氫酶Yeast臨床分析蔗糖酶SaccharomycesCerevisiae糖果、蜜餞青霉素?；窫scherichiaColi芐青霉素的脫酰作用表1胞內(nèi)酶舉例細(xì)胞破碎的必要性第二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日藥物名宿主用途胰島素大腸桿菌治療糖尿病人生長激素（HGH）大腸桿菌治療侏儒病α-干擾素大腸桿菌治療毛狀細(xì)胞白血病和卡波濟(jì)肉瘤表2幾種由大腸桿菌表達(dá)的胞內(nèi)重組藥物第三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日細(xì)胞壁的組成與結(jié)構(gòu)微生物革蘭氏陽性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌酵母菌霉菌壁厚/nm20~8010~13100~300100~250層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖（40％～90％）、多糖、胞壁酸、蛋白質(zhì)、脂多糖（1％～4％）肽聚糖（5％～10％）脂蛋白、脂多糖（11％～22％）磷脂、蛋白質(zhì)葡聚糖（30％～40％）甘露聚糖（30％）、蛋白質(zhì)（6％～8％）、脂類（8.5％～13.5）多聚糖（80％～90％）脂類、蛋白質(zhì)第四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日

圖1革蘭氏菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)圖（a）革蘭氏陽性菌（b）革蘭氏陰性菌第五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日

圖2酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖M—甘露聚糖；P—磷酸二酯鍵；G—葡聚糖第六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日

微生物細(xì)胞壁的形狀、強(qiáng)度取決于細(xì)胞壁的組成以及它們之間相互關(guān)聯(lián)的程度。內(nèi)因：連接細(xì)胞壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的共價(jià)鍵。外因：各類微生物的遺傳信息、培養(yǎng)條件、菌齡、外界環(huán)境等。第七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日破碎程度的評價(jià)

破碎程度常用細(xì)胞破碎率（%）表示。破碎率定義為被破碎細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞數(shù)量的百分比數(shù)，即：

Y（%）=[（N0-N）/N0]*100

其中N0——原始細(xì)胞數(shù)量；

N——經(jīng)t時(shí)間操作后保留下來的未損害完整細(xì)胞數(shù)量。第八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日N0和N的確定方法：直接計(jì)數(shù)法：通過平板計(jì)數(shù)技術(shù)或血球細(xì)胞器上用顯微鏡觀察，直接對適當(dāng)稀釋后的樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)。間接計(jì)數(shù)法：在細(xì)胞破碎后，測定懸浮液中細(xì)胞釋放出來的化合物的量（eg.可溶性蛋白、酶等）。第九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日細(xì)胞破碎技術(shù)第十頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日其他新的細(xì)胞破碎方法：

激光破碎法冷凍-噴射法高速相向流撞擊法第十一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日細(xì)胞聲波攪拌液壓冷凍壓力動(dòng)物細(xì)胞7777革蘭氏陰性芽孢桿菌和球菌6566革蘭氏陽性芽孢桿菌5(4)54酵母3.5342.5革蘭氏陽性球菌3.5(2)32.5孢子2(1)21菌絲16(1)5表3細(xì)胞對破碎的敏感度注：上述數(shù)字表示相對敏感度，括號則表示數(shù)字不確切。第十二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日常用的破壁方法珠磨法高壓勻漿法超聲波破碎法X-press法機(jī)械法非機(jī)械法酶溶法化學(xué)滲透法滲透壓法凍結(jié)融化法干燥法第十三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日常用的破壁方法——珠磨法作用機(jī)理：固體剪切作用圖3水平攪拌式珠麿機(jī)結(jié)構(gòu)示意圖1—細(xì)胞懸浮液2—細(xì)胞勻漿液3—珠液分離器4—冷卻液出口5—攪拌電機(jī)6—冷卻液進(jìn)口7—攪拌槳8——玻璃珠第十四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日第十五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日

破碎作用遵循一級動(dòng)力學(xué)定律：

第十六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日

破碎的速率和效率是所有操作參數(shù)的函數(shù)，如：珠體的大小、珠體的裝量、細(xì)胞濃度、操作溫度、料液性質(zhì)、攪拌器轉(zhuǎn)速與構(gòu)型等。此外，與攪拌器的設(shè)計(jì)和研磨腔的結(jié)構(gòu)也有關(guān)系，如轉(zhuǎn)盤外緣速度等。第十七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日

一般來說，磨珠越小，細(xì)胞破碎速度越快，但太小易于漂浮，并難以保留在研磨機(jī)的腔體中。通常實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，珠體直徑為0.2mm較好，工業(yè)規(guī)模不得小于0.4mm。不同的細(xì)胞類別及所需提取的酶在細(xì)胞中的位置等也是應(yīng)考慮的因素。第十八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日

有研究表明，減小磨珠直徑起先會(huì)提高卡樂酵母蛋白質(zhì)的釋放速度，但磨珠再小一些，蛋白質(zhì)的釋放速度反而稍有下降。

eg.從酵母細(xì)胞中提取D-葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，最好使用0.55-0.85mm大小的玻璃珠，而在提取α-D-葡萄糖苷酶時(shí)，則最好使用較大尺寸（如1mm直徑）磨珠。第十九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日

在一定范圍內(nèi)，增加珠體裝填量可以提高細(xì)胞破碎率。但超過某一限度時(shí)，反不利于細(xì)胞破碎和蛋白質(zhì)的釋放。為消除這種影響，必須提高攪拌器的功率，這樣又會(huì)增大釋放的熱量，給破碎帶來困難。一般研磨機(jī)腔體內(nèi)的填充密度控制在80%-90%，并隨珠體大小變化。第二十頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日

細(xì)胞濃度對懸浮液的流變特性具有影響，最佳的細(xì)胞濃度應(yīng)用實(shí)驗(yàn)來確定。一般用NetzschLM20研磨機(jī)破碎時(shí)，細(xì)胞濃度控制在40%左右。第二十一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日Currie等人的研究表明，操作溫度控制在5-400C范圍內(nèi)對破碎物的影響較小。常采用冷卻夾套和攪拌軸的方式來調(diào)節(jié)磨室的溫度。第二十二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日作用機(jī)理：液體剪切作用常用的破壁方法——高壓勻漿圖5高壓勻漿機(jī)裝置圖第二十三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日第二十四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日第二十五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日

此方法中影響破碎的主要因素是壓力、溫度和通過勻漿器的次數(shù)。有研究表明，當(dāng)懸浮液中酵母濃度在450-750kg/m3時(shí)，溫度由500C提高到300C，破碎率約提高1.5倍。

第二十六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日圖7細(xì)胞濃度及壓力大小對破碎率的影響勻漿次數(shù)圖8勻漿次數(shù)對破碎效果的影響第二十七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日常用的破壁方法——超聲波破碎作用機(jī)理：空化現(xiàn)象

由無數(shù)細(xì)小的空化氣泡破裂而產(chǎn)生的沖擊波的現(xiàn)象。第二十八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日

超聲波振動(dòng)在液體中傳播的音波壓強(qiáng)達(dá)到1atm時(shí)，功率密度為0.35w/cm2，這時(shí)超聲波的音波壓強(qiáng)峰值可達(dá)真空或負(fù)壓，但實(shí)際上無負(fù)壓存在，因此在液體中產(chǎn)生一個(gè)很大的力，將液體分子拉裂成空洞一空化核。此空洞非常接近真空，在超聲波壓強(qiáng)反向達(dá)到最大時(shí)破裂。

第二十九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日圖10USB600型微電腦控制超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)圖9超聲波細(xì)胞破碎儀的結(jié)構(gòu)示意圖第三十頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日振幅細(xì)胞懸浮液的黏度表面張力被處理懸浮液的體積珠粒的體積和直徑探頭的形狀和材料細(xì)胞懸浮液的流速影響參數(shù)第三十一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日

常用酶：溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鍵內(nèi)切酶、殼多糖酶等。常用的破壁方法——酶溶法

作用機(jī)理：

利用酶分解細(xì)胞壁上特殊的化學(xué)鍵。第三十二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日eg.蝸牛酶——從蝸牛的嗦囊和消化道中制備的混合酶，含有纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等20多種。第三十三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日

在某些情況下，不加外源酶也可使某些微生物發(fā)生自溶。

eg.谷氨酸生產(chǎn)菌（如乳糖發(fā)酵短桿菌）加入pH10的緩沖液（0.028mol/LNa2CO3—0.018mol/LNaHCO3

），配3%的細(xì)胞懸浮液，加熱至700C，保溫?cái)嚢?0min，菌體即自溶。

第三十四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日

所用的化學(xué)試劑：酸、堿、表面活性劑、脂溶性有機(jī)溶劑、EDTA鰲合劑、變性劑等。常用的破壁方法——化學(xué)滲透法

作用機(jī)理：改變細(xì)胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇性地滲透出來。第三十五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日酸、堿：用來調(diào)節(jié)溶液的pH值，改變細(xì)胞所處環(huán)境，改變蛋白質(zhì)的電荷性。有機(jī)溶劑：常用的是甲苯，被細(xì)胞壁脂質(zhì)層吸收后導(dǎo)致胞壁膨脹，造成細(xì)胞壁破裂。此外，丁醇、丙酮、氯仿等也常用到。第三十六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日表面活性劑：天然的如膽酸鹽、磷酯，合成的如SDS、Tween、TritonX-100等。變性劑：如鹽酸胍，與水中氫鍵作用，消弱溶質(zhì)分子間的疏水作用。第三十七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日eg.1.某些動(dòng)物細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）可采用SDS、去氧膽酸鈉等破壞細(xì)胞膜；而細(xì)胞壁較厚，采用溶菌酶處理效果較好。

2.用Triton從一種諾卡氏菌中選擇性地提取膽固醇氧化酶。第三十八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日

溫和化學(xué)滲透劑

溫和化學(xué)滲透劑一般是采用甘氨酸、丙氨酸等分子量較小的非極性Ｒ基氨基酸。其破碎機(jī)理可能是因?yàn)樾》肿拥母拾彼?、丙氨酸更易滲透到細(xì)胞壁中,通過氫鍵、范德華引力、靜電引力等化學(xué)親和力改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),從而改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性。第三十九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期日細(xì)胞類別變性劑清潔劑有機(jī)溶劑酶抗生素生物試劑鰲和劑革蘭氏陰性菌****