第九章核酸的分離與提純第一頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)核酸制備的基本原理第二頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一核酸的種類

脫氧核糖核酸（DNA）：細(xì)胞核，單鏈或雙鏈

核糖體RNA

核糖核酸（RNA）轉(zhuǎn)運(yùn)RNA

信使RNA細(xì)胞質(zhì)，單鏈或雙鏈第三頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一但無論哪核酸，在生物體中一般以核蛋白的形式存在，因此，為了提取制備核酸，必須將核蛋白解聯(lián)（即利用接聯(lián)劑將核蛋白裂解為核酸和蛋白）并去除蛋白，同時必須維持核酸的天然性狀，不使核酸發(fā)生變性或降解，操作上盡量簡化操作步驟，縮短操作時間，以減少各種不利因素對核酸的破壞，同時要求去蛋白迅速徹底。為了保證分離核酸的完整性及純度，在實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)注意以下條件和要求：第四頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一（1）盡量避免化學(xué)因素對核酸的降解

過酸或過堿以及其他化學(xué)因素將破壞多聚核苷酸鏈的磷酸二酯鍵，使核酸降解；核酸（特別是RNA）在堿性溶液中十分容易降解.因此抽提介質(zhì)的pH常以5.5-9.0為宜。第五頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一（2）減少物理因素對核酸的降解

物理因素主要是機(jī)械剪切力，包括強(qiáng)烈震蕩、攪拌、細(xì)胞突然置于低滲溶液中，以及讓溶液快速通過狹長的孔道；其次是凍融、高溫煮沸和輻射等，均將導(dǎo)致核酸的降解。機(jī)械剪切力主要破壞大分子量的線性DNA分子，而對分子量小的環(huán)狀質(zhì)粒DNA及RNA分子，破壞相對較小。第六頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一(3)防止核酸的生物降解細(xì)胞內(nèi)外各種核酸酶可作用于磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級結(jié)構(gòu)，使其降解；DNA酶需要Mg2+、Ca2+的激活，因此實(shí)驗(yàn)中常加入EDTA、檸檬酸鹽，以絡(luò)合核酸酶作用時所必需的Mg2+離子，以抑制DNA酶的活性；制備RNA則需克服核糖核酸酶（RNase）的降解作用。因?yàn)镽Nase不但分布廣泛，極易污染，而且耐高溫，即使加熱到蛋白變性，Rnase的活力也不會完全喪失，且具有驚人的回復(fù)力，而細(xì)胞內(nèi)的核蛋白又總是和它聯(lián)在一起，若去除不徹底，它將部分恢復(fù)活力，導(dǎo)致RNA降解。第七頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一生物降解是RNA提取過程的主要危害，儲存的RNA制品也不例外，因此，為了抑制核酸酶的活性，一般在低溫下（4℃或0℃，甚至-20℃左右）進(jìn)行。進(jìn)行核酸分離時最好用新鮮生物組織或細(xì)胞樣品，若不能馬上進(jìn)行提取，應(yīng)將材料置液氮中或-80℃冰箱保存。第八頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一分離純化核酸總的原則一是應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性，這是研究核酸結(jié)構(gòu)與功能的最基本要求；二是要排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等其他物質(zhì)的污染。純化的樣品不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑或過高濃度的金屬離子；蛋白質(zhì)、脂類、糖類等的污染應(yīng)降低到最低程度；無其他核酸的污染，如提取DNA時，應(yīng)去除RNA。第九頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一一般程序

1、供體的核酸分離

供體細(xì)胞培養(yǎng)收集(菌體)細(xì)胞細(xì)胞破碎分離總DNA

分離細(xì)胞器分離總RNA

分離細(xì)胞器DNARNApoly(A)RNA特異性RNA

染色體DNA(組建基因組文庫)第十頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一2、載體DNA分離

載體DNA

感染或轉(zhuǎn)染細(xì)胞（病毒型）轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞（質(zhì)粒型）分離病毒顆粒培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞、收集菌體

病毒載體DNA分離與純化破碎細(xì)胞

質(zhì)粒DNA分離與純化第十一頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一3、DNA片段的分離

DNA限制酶切凝膠電泳分離特定DNA片段的回收4、質(zhì)量評估

1）

凝膠電泳

2）光密度值測定

3）限制酶切分析第十二頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一第二節(jié)核酸制備的基本方法第十三頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一核酸制備的步驟（1）抽提組織或細(xì)胞的破碎、消融。抽提核酸必須事先將生物材料破碎或消融，這關(guān)系到核酸回收率的高低。破碎與消融組織細(xì)胞，通常有使用勻漿器、搗碎器的機(jī)械方法以及溫和的反復(fù)凍融法，使用表面活性劑或各種酶處理的方法。第十四頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一（2）抽提核酸，去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)、多糖、脂類，去除鹽、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)，以及去除其他不需要的核酸分子；（3）核酸的精制純化。第十五頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一一、細(xì)胞的破碎一般動物組織的細(xì)胞膜較脆弱，易破碎，而植物和微生物的細(xì)胞比較牢固。細(xì)胞破碎的方法很多，可根據(jù)組織特性和核酸分離目的加以選擇。第十六頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一1．物理方法(1)機(jī)械碾碎對于動物組織(如鼠肝、兔肝等)，一般多采用勻漿的方法。即將組織剪碎置研缽中，研碎。為了提高研磨效果，可加入一定量的石英砂。但要注意石英砂對有效成分的吸附作用。用勻漿器處理，也能把動物細(xì)胞破碎，此法較溫和，適于實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。若需大規(guī)模生產(chǎn)，則可用電動研磨法，酵母、植物組織的細(xì)胞破碎也可用此法。第十七頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一(2)組織搗碎器法是一種劇烈的破碎細(xì)胞的方法。搗碎器(8000-10000r/min)處理30～45s，植物和動物細(xì)胞能完全破碎。若用它破碎酵母菌和細(xì)菌的細(xì)胞，則需加入石英砂方才有效。在搗碎期間必須保持低溫，以防溫度升高引起有效成分變性，同時搗碎的時間不宜太長。第十八頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一(3)超聲波法是借助聲波的振動力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器的有效方法。由于細(xì)菌的外部有一層細(xì)胞壁，破壁較為困難，因此用超聲波處理細(xì)菌和酵母的時問要長一點(diǎn)。有些菌體破碎需要5～l0min或更長，如果在細(xì)胞浮液中加石英砂則可縮短時間。為了防止電器長時間運(yùn)轉(zhuǎn)產(chǎn)生過多的熱量，常采用間歇處理和降低溫度的方法進(jìn)行。第十九頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一(4)壓榨法是一種溫和、徹底破碎細(xì)胞的方法。即用高壓迫使幾十毫升細(xì)胞懸液通過一個小于細(xì)胞直徑的小孔，致使細(xì)胞被擠壓破碎。第二十頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一2．溶脹和自溶第二十一頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一(1)溶脹概念：在低滲溶液，如低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子將大量進(jìn)入細(xì)胞，致使細(xì)胞膜膨脹破裂的現(xiàn)象稱為溶脹。步驟：將細(xì)胞置低溫下冰凍一定時間，然后取出至室溫下(或40℃左右)迅速融解。如此反復(fù)凍融多次，細(xì)胞可在形成冰粒和增高胞液鹽濃度的同時，發(fā)生溶脹，以致破碎。第二十二頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一(2)自溶概念：細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身所具有的各種水解酶作用下，發(fā)生溶解的現(xiàn)象稱為自溶。注意：應(yīng)用此法時要特別小心操作，因?yàn)樗饷覆粌H可破壞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，同時也可使某些有效成分在自溶時分解。第二十三頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一3．化學(xué)處理用脂溶性的溶劑(如丙酮、氯仿、甲苯等)或表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉)處理細(xì)胞時，可使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)部分溶解，導(dǎo)致整個細(xì)胞破碎。第二十四頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一4．生物酶降解生物酶有降解細(xì)菌細(xì)胞壁的功能。在用此法處理細(xì)菌細(xì)胞時，先是細(xì)胞壁消融，隨之而來的是因滲透壓差引起的細(xì)胞膜破裂，最后導(dǎo)致細(xì)胞完全破碎。第二十五頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一二、核酸提取的基本方法第二十六頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一1．去垢劑(SDS)法SDS(sodiumdodecylsulfate)：即十二烷基硫酸鈉，是一種有效的細(xì)胞消溶劑、核酸酶抑制和蛋白變性劑，也是一種去污劑。去垢劑法由Marmur于1961年創(chuàng)建，最早用于從細(xì)菌中提取DNA。第二十七頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一原理：抽提核酸時利用SDS的非極性基團(tuán)破壞蛋白質(zhì)分子的次級鍵，使蛋白質(zhì)變性，達(dá)到使核蛋白解聯(lián)、變性和去除蛋白的目的。變性后的蛋白仍留在溶液中不生成沉淀。為了將同時存在于溶液中的核酸和蛋白分開，可在室溫條件下加入1/2體積飽和硫酸銨使蛋白沉淀。特點(diǎn)：此法得率高，對核酸影響小，但制品中仍殘留微量蛋白。SDS在低溫或有兩價金屬離子或鉀離子存在時將形成沉淀，使用時應(yīng)該注意。第二十八頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一2．酚抽提法酚也是一種蛋白表面變性劑。球狀蛋白在水溶液中其親水性氨基酸殘基的側(cè)鏈位于外側(cè)，疏水性氨基酸的側(cè)鏈位于內(nèi)側(cè)，酚法于1957年為Kirby建立，最早用于DNA的抽提。第二十九頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一酚的作用機(jī)制:可能是插入蛋白結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，破壞各種氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)問的次級鍵，使蛋白的結(jié)構(gòu)翻轉(zhuǎn)，即原來存在于內(nèi)側(cè)的疏水性氨基酸殘基側(cè)鏈轉(zhuǎn)向外側(cè)，而外側(cè)的親水性氨基酸殘基側(cè)鏈則轉(zhuǎn)向內(nèi)側(cè)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。酚還能使核酸酶失活。第三十頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一3．CTAB法CTAB(eetyltriethylammoniumbromide):即十六烷基三乙基溴化銨，是一種去污劑。特點(diǎn)：此法相對較為簡單，特別適用于植物材料，已成功地從一系列的單子葉和雙子葉植物中提取出總DNA。此法提取植物DNA時，可采用氯仿/異戊醇反復(fù)抽提去蛋白，通過高鹽緩沖液的選擇性沉淀去除多糖類雜質(zhì).第三十一頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一機(jī)制：可溶解細(xì)胞膜，能與核酸形成復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液中(0.7mol/LNaCl)是可溶的，當(dāng)溶液鹽濃度降低到一定程度(0.3mol/I．NaCl)時，卻會從溶液中沉淀出來，因此通過離心便可將CTAB與核酸的復(fù)合物同蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)分開。然后將此復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，因CTAB溶解于乙醇，離心后即可得DNA沉淀。第三十二頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一優(yōu)點(diǎn)既適用于新鮮的植物，也可用于經(jīng)脫水處理的材料，能夠很好地去除多糖類雜質(zhì)，對于含糖較高的植物材料可優(yōu)先采用。另一優(yōu)點(diǎn)是提取的前期能同時得到高含量的DNA及RNA，如果后續(xù)實(shí)驗(yàn)對兩者都有需要，則可分別進(jìn)行純化。如只需要DNA，則加入RNase除去RNA；若只需RNA，則加入DNase去掉DNA。該法制得的DNA雖然純度不很高，但仍能滿足限制性內(nèi)切核酸酶分析、PCR反應(yīng)以及DNA重組克隆的要求。第三十三頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一4．濃鹽法機(jī)制：高濃度的鹽可以破壞核酸和蛋白質(zhì)之間的次級鍵，使核蛋白解聯(lián)。一般先用lmol/LNaCl或lmol/LNaClO4進(jìn)行抽提，再加入氯仿/異戊醇離心去蛋白，最后用甲醇或異丙醇使核酸沉淀。其中的氯仿可以使蛋白表面變性，幫助去蛋白。異戊醇可以消泡以維持離心層的穩(wěn)定。特點(diǎn)：該法對核酸的損傷較小，但由于去除蛋白不夠徹底，常與其他方法結(jié)合使用。第三十四頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一5．高通量的RNA分離技術(shù)第三十五頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一(1)微量移液法(micropipeting)由Karrwer等人于1995年建立的一種方法。特點(diǎn)：此法借助毛細(xì)管或微量移液管直接提取細(xì)胞的內(nèi)含物，進(jìn)行RNA抽提。第三十六頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一操作過程用激光移液管拉伸器(1aserpipettepuller)將毛細(xì)石英管拉成孔徑為l0um的微量移液管，將其頂端彎曲23°，以便穿透細(xì)胞壁。微量移液管被安裝在連接了氣泵的微操縱器上，通過負(fù)壓將大約1ulRNA提取液(100mmol/LTris-HCl，pH8.0；500mmol/LLiCl；10mmol/LEDTA；1%SDS；5mmol/LDTT)壓入微量移液管。裝有提取液的微量移液管被降低到葉片表面，微量移液管頂點(diǎn)的那一小滴提取液在275kPa氣壓作用下被排出.第三十七頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一一旦微量移液管尖端被清空后，立即供給1.3kPa的負(fù)壓，這時微量移液管就插入到目的細(xì)胞內(nèi)。一經(jīng)插入，細(xì)胞內(nèi)含物就被吸進(jìn)微量移液管?？梢悦黠@地看到，細(xì)胞立刻癟了下去。然后，微量移液管離開細(xì)胞，內(nèi)含物被注入到10u1RNA提取液中，用69kPa和1.3kPa正、負(fù)壓反復(fù)作用，以便將微量移液管頂端漂洗干凈。此法可直接從葉片的表皮細(xì)胞、防御細(xì)胞以及葉肉細(xì)胞中提取mRNA，而葉片卻不受到損傷。第三十八頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一隨后，再加入10u1RNA提取液，其中含有50ug連接了oligo(dT)-的磁力珠，混合均勻，22℃下靜置l0min。再用2ou11倍的反轉(zhuǎn)錄緩沖液(50mmol/Ltris-HCl，pH8.3；75mmol/LKCl；3mmol/LMgCl2；10mmol/LDTT)洗兩次，即可將結(jié)合在磁力珠上的mRNA洗脫下來。第三十九頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一第四十頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一(2)激光微解剖法(1aser—capturemicrodissection，LCM)該法是將一塊被冷凍或被石蠟包埋的組織切成薄片，然后所需要的部位被激光解剖下來，再利用黏膜通過靜電作用迅速地將其吸附，并立即轉(zhuǎn)移到RNA提取液中。第四十一頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一第四十二頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一優(yōu)點(diǎn)：①它減少了對組織的處理，可避免RNA表達(dá)輪廓(profile)的改變；②因?yàn)槟承?shí)驗(yàn)，特別是對時鐘基因的研究，時間因素至關(guān)重要，采用此法可減少采樣時間對實(shí)驗(yàn)的影響。第四十三頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一(3)原生質(zhì)體分離法(protoplastingandsorting)特點(diǎn)：是一種快速而準(zhǔn)確地從分生組織的細(xì)胞中提取RNA的技術(shù)，已應(yīng)用于擬南芥根系全球性基因表達(dá)圖譜的制作。原理：首先需將熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，用酶處理破壁后，通過紫外照射使那些表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞產(chǎn)生熒光，再通過熒光感受分離儀(flurescence-activatedcellsorter，簡稱FACS)將其從特定組織或區(qū)域中分離出來，進(jìn)而制得RNA第四十四頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一第四十五頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一三、核酸的濃縮和沉淀第四十六頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一1．核酸的濃縮若溶液中DNA含量低，而且容積較大時，常需進(jìn)行濃縮，以便進(jìn)一步沉淀和純化。常用的核酸濃縮方法是真空干燥法。此法比較溫和，特別適用于小量樣品的濃縮。此外，還有以下兩種方法：第四十七頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一(1)丁醇抽提濃縮法正丁醇或仲丁醇能吸收大量水，而DNA不溶于丁醇。利用該特性，向DNA溶液中反復(fù)加入等體積正丁醇或仲丁醇，振蕩混合后離心，去除有機(jī)相，可顯著減少DNA溶液的體積并濃縮DNA。第四十八頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一(2)聚乙二醇(PEG)水沉淀法聚乙二醇同樣具有吸水能力。將DNA溶液裝入透析袋，包埋在聚乙二醇(分子量6000～12000為宜)中，聚乙二醇吸水液化，同時DNA溶液體積減小、可通過更換PEG干粉達(dá)到濃縮的目的。第四十九頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一2．核酸的沉淀

沉淀是濃縮核酸最常用的方法。其最大優(yōu)點(diǎn)是通過沉淀來改變和重新調(diào)節(jié)核酸溶液的濃度，并可去除溶液中某些鹽類和雜質(zhì)，在一定程度上將核酸純化。核酸是多聚陰陽離子的水溶性化合物，它與鈉、鉀、鎂形成的鹽在多種有機(jī)溶劑中不溶解，也不會變性。常用的有機(jī)溶劑有乙醇、異丙醇、聚乙二醇等。第五十頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一(1)常用于沉淀核酸的鹽類及其濃度1)NaAc：沉淀DNA、RNA最常用的鹽類，終濃度為0．3mol/L(pH5.0)。2)NaCl：對于含有SDS的DNA樣品是優(yōu)先選用的試劑，終濃度為0.2mol/L。3)NHAc：4種dNTP在NHAc溶液中均具較高的溶解度，通過乙醇沉淀DNA，可去除大部分dNTP。第五十一頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一4)KAc：沉淀效果與NaAc相同。終濃度為0.3mol/L。但核酸的鉀鹽很難溶于含SDS的溶液，若在下一步選用含SDS的緩沖液溶解核酸沉淀時，則不宜選用此法沉淀核酸。5)LiCl：在乙醇中溶解度非常好，在70％乙醇中不與DNA共沉淀，且高濃度0.8mol/L)時可直接沉淀大分子RNA(包括rRNA、mRNA)，故常用于RNA的沉淀。第五十二頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一6)MgCl2：Mg2+是核酸沉淀中的有效離子，當(dāng)核酸濃度低于0.1ug/ml或其長度小于100個核苷酸時，加入l0mmol/L的Mg2+可明顯提高核酸沉淀的回收率。Mg2+對核酸的沉淀并不需要低溫條件。即使在室溫條件下，10min之內(nèi)也比NaAc在0℃時沉淀DNA的效率高2倍。第五十三頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一(2)沉淀核酸的有機(jī)溶劑1)乙醇：沉淀DNA一般首選乙醇，它對鹽類沉淀較少，含在DNA沉淀中的少量乙醇易被蒸發(fā)去除，不影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。在適當(dāng)?shù)柠}濃度下，兩倍樣品容積的乙醇可有效沉淀DNA，對于RNA則需將乙醇用量增至2.5倍。第五十四頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一優(yōu)點(diǎn)是所需的用量較少且速度快，適用于濃度低而體積大的DNA沉淀。0.54～1.0倍的異丙醇可選擇性地沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，但對5SRNA、tRNA及多糖不產(chǎn)生沉淀，一般不需在低溫條件下長時間放置。缺點(diǎn)是易使鹽類與DNA共沉淀，在DNA沉淀中的異丙醇難以揮發(fā)除去，所以通常要用70％乙醇漂洗DNA沉淀數(shù)次.(2)異丙醇:第五十五頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一(3)聚乙二醇(PEG)：可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同分子量的DNA片段。應(yīng)用PEG6000進(jìn)行沉淀時，其使用濃度與DNA片段的大小成反比。PEG沉淀一般需要加入0.5mol/LNaCl或10mmol/LMgCl2。除去DNA沉淀中PEG的最簡單有效的辦法是用70％的乙醇漂洗2次。第五十六頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一(4)精胺(spermine)：精胺不是有機(jī)溶劑，但可快速有效地沉淀DNA，適用于少量DNA的純化。原理:精胺與DNA結(jié)合后，使DNA在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)與DNA分子分開，達(dá)到純化DNA的目的。對于大于60bp的DNA片段，其濃度在0.1～100ug/ml左右，也有很好的效果。沉淀DNA的要求是溶液中無鹽或低鹽(小于0.1mol/L)，最后可用70％的乙醇漂洗2次以去除DNA沉淀中的精胺。第五十七頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一(3)核酸沉淀的離心力與離心時間大多數(shù)DNA的沉淀在0～4℃、12000g離心10min即可。若DNA片段小于100個核苷酸時，則需要超速離心。對于pg水平的核酸沉淀，應(yīng)加入tRNA作為載體共沉淀。第五十八頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一四、核酸的純化第五十九頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一方法:很多，如超速離心、柱層析、免疫沉淀、凝膠電泳等。實(shí)驗(yàn)室最常用的純化方法:酚/氯仿抽提法。該方法的標(biāo)準(zhǔn)程序是用酚抽提一次，酚/氯仿(1:1)抽提一次，氯仿抽提一次。如果情況需要可再重復(fù)幾次。基本原理:是通過交替使用酚、氯仿這兩種不同的蛋白質(zhì)變性劑來增加去除蛋白質(zhì)的效果。第六十頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一1．低分子物質(zhì)的去除可以通過加入乙醇或用鹽溶液選擇性沉淀進(jìn)行分離，也可以通過透析除去。例如:在醋酸根離子存在下加入乙醇，或在高濃度的鹽溶液中，或于低溫下的33%硫酸銨介質(zhì)中，高分子量的RNA都可以沉淀。第六十一頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一高分子物質(zhì)主要指蛋白質(zhì)和黏多糖.2．高分子物質(zhì)的去除第六十二頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一去此類高分子物質(zhì)常用的方法有:如果核酸不是采用酚法制備的，可在對氨基水楊酸等化合物存在的條件下，將核酸制品連續(xù)用苯酚進(jìn)行處理，此時DNA和RNA均進(jìn)入水相，蛋白質(zhì)沉淀留在酚相。然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，也可以用酚或SDS反復(fù)搖蕩抽提。如果是用酚法制得的核酸，則大部分蛋白質(zhì)已被除去，若要進(jìn)一步除去其中的微量蛋白，可用氯仿/異戊醇或辛醇振蕩抽提，同時加熱處理使蛋白質(zhì)凝固形成沉淀，離心分離，核酸即留在溶液中。

第六十三頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一第二個方法是Kirby創(chuàng)建并經(jīng)Ralph和Bellamy等改良的有機(jī)溶劑法。即在pH8的1.25mol/L磷酸緩沖液中，用2-甲氧基乙醇抽提，多糖溶于水相，核酸在有機(jī)相，加入CTAB(十六烷基三乙基溴化銨)沉淀核酸，然后在70%乙醇中用醋酸鈉處理，以鈉鹽的形式回收核酸。此外，也可以用鈣鹽沉淀DNA，再用草酸鉀處理形成DNA鉀鹽回收，然后用離子交換層析法吸附DNA使之與多糖分離。第六十四頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一3．不同類型核酸的分離通常可采用酶處理、有機(jī)溶劑抽提、鹽分步沉淀和密度梯度離心等方法。從DNA中除去RNA的有效方法是利用RNase選擇性地降解RNA。但由于RNase中常含有極微量的DNase，因而必須先將RNase試劑于80～100℃)加熱處理5～10min。反之，為了從RNA制品中除去DNA，可加入DNase降解DNA，加入的酶則利用酚法除去。其他除去DNA的常用方法是苯酚抽提法。第六十五頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一4．同類核酸的分離在初步純化的RNA制品中，常含有各種RNA和某些降解RNA的混合物；在DNA制品中則往往含有變性或降解的DNA，通常多采用梯度離心、電泳、柱層析及反復(fù)萃取抽提等方法進(jìn)一步純化或分級分離。第六十六頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一五、超離心技術(shù)在核酸分離中的應(yīng)用第六十七頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一核酸的分離和純化，通常采用密度梯度離心法。密度梯度離心是一種帶狀分離法。密度梯度離心法包括密度梯度差速離心、等密度離心和浮力密度梯度離心。梯度溶液所使用的成分有蔗糖、甘油、氯化銫、氯化銣、右旋糖酐和蔗糖多聚物等。這些物質(zhì)本身對核酸、蛋白質(zhì)等具有化學(xué)惰性，因此不會導(dǎo)致其分子間的聚集，而且由于這些物質(zhì)的黏性大，可以維持重力的穩(wěn)定性，防止由于局部溫度變化或機(jī)械振動所產(chǎn)生的對流,起著穩(wěn)定離心液保證分離效果的作用.

第六十八頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一第三節(jié)DNA與RNA的制備第六十九頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一一、供體DNA的分離與純化

要求：盡可能地保持其高分子量，無其它污染物.1、

基因組大?。旱谄呤?，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一

染色體細(xì)菌3300~4200kb酵母15,000kb果蠅1.28x105kb人3x106kb植物2x105~1x108kb天花病毒288kb痘病毒196kb質(zhì)體幾~100以上kb

線粒體

藻類線狀15kb酵母環(huán)狀19~78kb植物環(huán)狀100~150kb動物(扁蟲到人)環(huán)狀15~18kb錐蟲網(wǎng)狀6000

kb(幼體)短膜蟲網(wǎng)狀30,000

kb(幼體)(Kinetoplast）

葉綠體雙子葉植物121（菠菜）~154kb（豌豆）單子葉植物151（玉米）~182kb（浮萍）藻類132（裸藻）~191kb（衣藻）第七十一頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一

1、

DNA分離純化過程

破碎細(xì)胞+DNA抽提液(EDTA、去污劑、還原劑)65℃溫育20’冰浴冷卻離心去細(xì)胞碎片苯酚抽提法①

CsCl密度梯度離心②第七十二頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一2)CsCl密度梯度離心上清液加入固體CsCl與EtBr溶液室溫下超速離心(45,000rpm）16小時穿孔取出DNA（320nm）異丙醇抽提溴乙錠緩沖液透析除去殘余CsCl兩倍體積冷乙醇沉淀DNA離心、洗滌、干燥1)苯酚抽提法上清液緩沖液用水飽和苯酚抽提2~3次上層液相用氯仿抽至界面無蛋白變性物上層液相用兩倍體積冷乙醇沉淀沉淀物用70%冷乙醇洗滌,干燥溶于緩沖液加入RNAase處理除去RNA苯酚氯仿抽提沉淀干燥

第七十三頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一*兩種方法比較：CsCl法操作步驟少，分離DNA分子量大，耗財多，且需超速離心機(jī)。苯酚法耗時少，不需昂貴儀器，但操作步驟多，易使DNA分子斷裂。若小心操作，所獲DNA亦符合要求。**上述兩種分離方法都包含了下述四個分離步驟ⅰ.可溶與不可溶物分離：高速離心除去細(xì)胞碎片，保留上清液。ⅱ.使蛋白質(zhì)分離：苯酚抽提或超速離心ⅲ.使RNA分離：RNase處理或超速離心ⅳ.使DNA與其它可溶物分離第七十四頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一2、細(xì)胞器DNA的分離

植物組織用核分離緩沖液勻漿過濾濾液離心(2000g,10’,4℃)核緩沖液使核裂解(含0.5%TritonX-100)抽提DNA植物組織細(xì)胞器緩沖液勻漿離心(100g,10’,4℃)除去細(xì)胞核離心(1800g,10’,4℃)分離葉綠體離心(10,000g,10’,4℃)分離線粒體DNase除去細(xì)胞器外DNA加入EDTA使DNase失活純化細(xì)胞器細(xì)胞器裂解提取DNA第七十五頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一二、

載體DNA的分離與純化1、質(zhì)粒載體DNA的分離關(guān)鍵：如何使質(zhì)粒DNA與宿主染色體DNA分開原理：質(zhì)粒DNA比染色體DNA小得多，在DNA抽提過程中，染色體DNA斷裂成小片段(線狀)，質(zhì)粒DNA仍保持超螺旋構(gòu)型.

第七十六頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一

方法：

ⅰ.超速離心：利用兩種DNA分子的大小和空間構(gòu)型

ⅱ.變性法：在變性條件下使染色體DNA變?yōu)閱捂湥|(zhì)粒DNA仍保持環(huán)狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)變性條件發(fā)生迅速變化時，前者仍不能復(fù)性，而后者又可回復(fù)到天然構(gòu)型。變性條件可采用加熱煮沸法或堿變性法上述方法亦可用于ss環(huán)狀病毒DNARF型的分離,質(zhì)粒DNA的氯霉素擴(kuò)增使用并不廣泛（菌株和載體）第七十七頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一2、噬菌體載體DNA的分離

純凈病毒顆粒病毒載體DNAM13mp載體可采用質(zhì)粒DNA的分離方法。第七十八頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一二、RNA的分離與純化1.

制備RNA的關(guān)鍵-防止內(nèi)外源RNase的作用1)

RNase的特點(diǎn)：抗酸抗堿,具很廣pH作用范圍;抗高溫嚴(yán)寒(0~65℃均具活性）；抗變性劑2)

解決辦法：外源RNase—高溫，焦磷酸二乙酯(DEPC)處理所有溶液（Tris·HCl除外）和器皿，操作者帶手套。內(nèi)源RNase—高溫抽提，強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑，RNase抑制劑，蛋白酶K等。第七十九頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一2.

總RNA的制備根據(jù)所用蛋白質(zhì)變性劑種類不一樣分為以下三種制備方法：

1）熱苯酚抽提法

2）胍鹽法：異硫氰酸胍和硫氰酸胍

3）LiCl/尿素法其中以胍鹽法最好，對于從那些RNase含量很高的組織（胰臟）中提取RNA特別有效，可使RNase迅速變性，制備的RNA有較高翻譯活性。在RNA制備中，細(xì)胞破碎與蛋白質(zhì)變性是同步進(jìn)行的。第八十頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一3.

多聚核糖體RNA的制備

1)

多聚核糖體的分離①超速離心法（30-40萬g，離心2-3h）②鎂鹽沉淀法（0.1MMg++）③分級分離法—分離特異性多聚核糖體

第八十一頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一i.結(jié)合與游離核糖體的分離,這種方法可避免溶酶體破裂.ii.核糖體大小分級分離，利用連續(xù)密度梯度分離特大和特小的多聚核糖體iii.核糖體免疫沉淀法

*直接免疫沉淀法新生肽鏈+抗體蔗糖密度梯度離心

**間接免疫沉淀法新生肽鏈+抗體+抗-抗體（二抗）不可溶復(fù)合物離心分離

第八十二頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一***免疫親和層析法新生肽鏈-抗體復(fù)合物不溶性交聯(lián)抗原基質(zhì)親和層析柱吸附洗脫免疫沉淀法優(yōu)點(diǎn)：可分離到含量僅為1%的mRNA，但必須使用高純度的抗體，不能發(fā)生交叉反應(yīng)和污染核酸酶2)

多聚核糖體RNA的分離純化多聚核糖體+SDS蔗糖密度梯度離心或蛋白酶K-苯酚抽提第八十三頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一4.

RNA的分級分離1)

分子量大小分級分離

i.

蔗糖密度梯度離心

ii.凝膠電泳2)

核酸序列分級分離

i.

分子雜交法：適用于同源性很高的RNA的分離DNA分子變性結(jié)合到NCFRNA·DNA雜交洗滌洗膜乙醇沉淀第八十四頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一ii.

親和層析法：低聚dT纖維素:用于poly(A)較長的mRNA；多聚U瓊脂糖:用于poly(A)較短的mRNA（<20A）RNA進(jìn)樣吸附洗滌洗脫收集260nm處吸收峰樣品

乙醇沉淀iii.

無poly(A)mRNA的分離純化多聚核糖體核糖體亞基+mRNP離心

mRNP蛋白酶KmRNA低聚（dT）纖維素層析洗出液乙醇沉淀（無多聚AmRNA）第八十五頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一細(xì)胞裂解物

胍鹽法

總RNA分子雜交法—

特異RNA分子

熱苯酚法凝膠電泳圍RNA大小分級分離大小范蔗糖密度梯度離心

一定

LiCl/核酸序列

尿素法離心分級分離親和層析法—poly（A）RNA分子

高速離心法

全部多聚核糖體

上清液鎂鹽沉淀法蔗糖密度梯度離心—結(jié)合與游離多聚核糖體分級分離法

蔗糖連續(xù)密度—一定范圍大小核糖體多聚核糖體RNA免疫沉淀法——特異性多聚核糖體

第八十六頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一第四節(jié)核酸電泳

第八十七頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一1.

種類

1)按凝膠材料分:聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳(普通瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖)2)按電泳裝置分:水平式/瓊脂糖凝膠;豎式/聚丙烯酰胺凝膠3)兩種方法比較：分離效果和分離范圍;操作難易2.

用途

瓊脂糖凝膠用于DNA和RNA的常規(guī)分析；聚丙烯酰胺凝膠常用于小分子核酸分析。3.

凝膠電泳的一般程序制膠點(diǎn)樣電泳染色觀察第八十八頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一二、DNA電泳1.

DNA分子種類

1)線狀DNA—單鏈與雙鏈，ss-DNA電泳時要注意局部區(qū)域形成ds-DNA，造成遷移距離不確定

2)環(huán)狀DNA-單鏈（如M13mp）和雙鏈（質(zhì)粒DNA）

3)線狀ds-DNA電泳:使用頻率最高的一種電泳第八十九頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一

這類DNA分子在電泳過程中遷移的距離受以下幾個因素的影響：

i.

分子量的大小:遷移距離與分子量的常用對數(shù)成反比

ii.凝膠濃度:濃度越高，移動距離越短，適合分離低分子量DNA濃度越低，移動距離越長，適合分離高分子量DNAiii.電壓:低電壓時，遷移率與電壓成正比；電壓增高時，不同大小DNA片段遷移率增大是不同的。iv.堿基組成與溫度:不受影響,溫度高可導(dǎo)致DNA帶變形或解鏈。第九十頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一4)環(huán)狀ds-DNA電泳:常用于質(zhì)粒DNA的初步鑒定5)線狀ss-DNA電泳鏈分離凝膠：化學(xué)定序時，用于單鏈分離。DNA雙鏈互補(bǔ)，但組成不一樣，仍可分離（機(jī)理不詳），電泳時形成三條帶：變性雙鏈，兩條單鏈。

核酸定序凝膠(染料指示劑)：為避免局部區(qū)域產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)，可采用各種變性措施，如煮沸樣品，提高電泳溫度，凝膠中加入變性劑（尿素、甲醛、甲胺等）第九十一頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一三.RNA凝膠電泳

方法：不同的RNA電泳方法是依據(jù)使RNA分子變性所采取的方法。這些方法不僅要使RNA分子在點(diǎn)樣時是一級結(jié)構(gòu)，而且在整個電泳過程中也保持一級結(jié)構(gòu)。

1.

乙二醛/二甲基亞砜法原理：乙二醛可以與核酸、核苷酸及堿基發(fā)生反應(yīng)，特別是鳥苷形成一個穩(wěn)定的附加環(huán)，從而阻止GC堿基的互補(bǔ)作用發(fā)生步驟：RNA+10mM羥甲基醛和50%DMSO混合50℃、1h變性點(diǎn)樣電泳染色觀察

2.

羥甲基汞法原理：羥甲基汞可與RNA分子的嘌呤或嘧啶堿基發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)部位是在可形成氫鍵的亞氨基處。步驟：RNA+10mM羥甲基醛點(diǎn)樣在含4mM羥甲基醛的瓊脂糖凝膠上電泳染色觀察第九十二頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一3.

甲醛法步驟：RNA+2.2M甲醛+50%甲胺點(diǎn)樣在含2.2M甲醛瓊脂糖凝膠上MOPS緩沖液電泳染色觀察其它變性劑，如尿素、甲胺等也可用于RNA電泳.4.

三種方法的比較第一種方法安全，但由于反應(yīng)是不可逆的，由此回收的RNA樣品用于體外翻譯效果不好。第二、三種方法的反應(yīng)可逆，回收RNA樣品可用于體外翻譯反應(yīng)，但操作必須小心，因兩種變性劑有毒。第九十三頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一五、蛋白質(zhì)電泳方法：變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，前者常稱之為SDS。差別：有無變性劑用途：非變性凝膠可用于蛋白質(zhì)的分離純化過程中，可直接用于酶促反應(yīng)（顏色變化）SDS可用于蛋白質(zhì)分子量、亞基組成的測定。mRNA翻譯產(chǎn)物，基因表達(dá)產(chǎn)物測定等。第九十四頁，共一百零四頁，編輯于2023年，星期一六、核酸片段的分離與回收

1.方法—用于DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的回收

1)

電洗脫法:利用電泳方法將凝膠中的特定核酸分子到其它介質(zhì)中；

2)濾紙法—核酸凝膠染色長波紫外光確定位置在分離帶前方切一口子并插入濾紙條(其背面覆蓋透析袋膜)

電泳至DNA帶全部進(jìn)入濾紙條洗脫DNA純化、沉淀

3)透析袋法—切下含DNA帶瓊脂塊放入透析袋，封口放入電泳槽電泳2~3小時至全部DNA離開凝膠塊