細胞生物學常用實驗技術

當前第1頁\共有99頁\編于星期四\21點

cellularlevelSubcellularlevel

Molecularlevel當前第2頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第3頁\共有99頁\編于星期四\21點

顯微技術細胞分離技術細胞培養(yǎng)技術細胞組分的分級分離細胞示蹤技術細胞分子生物學技術當前第4頁\共有99頁\編于星期四\21點一、顯微鏡技術microscopy

μm

微米

=10-6m

nm

納米

=10-9m

?

埃

=10-10m

(一)光學顯微鏡技術

利用光線照明,將微小物體形成放大影像的儀器

當前第5頁\共有99頁\編于星期四\21點1.顯微鏡的分辨率顯微鏡或人眼在25cm的明視距離處,能分辨被檢物體微細結構最小間隔的能力。

d=

光學顯微鏡的分辨極限0.2μm0.61λ

nsinθ

當前第6頁\共有99頁\編于星期四\21點100μm0.2μm當前第7頁\共有99頁\編于星期四\21點2.光鏡標本切片的制備

(1)

固定

定義：將組織浸入化學試劑中，通過在細胞中大分子間形成交聯(lián)，保持細胞中原有結構的形態(tài)和位置的過程。

固定的目的：

A防止組織自溶或腐敗

B保持細胞原有的形態(tài)

C保持細胞各種成分的原有位置

常用固定劑：乙醇、甲醛、戊二醛

當前第8頁\共有99頁\編于星期四\21點(2)脫水

定義：借助某些化學溶劑置換組織內(nèi)水分的過程。

常用的脫水劑：酒精

(3)包埋

定義：將組織塊包入包埋劑使組織硬化的過程。

常用的包埋劑：液體石蠟、樹脂

(4)切片

1-10μm

當前第9頁\共有99頁\編于星期四\21點（5）染色采用某些化學物質(zhì)特異性或選擇性地與細胞內(nèi)的某些成分相互作用，從而原位顯示細胞某種成分或結構的方法

A選擇性染色

考馬斯亮藍–

蛋白質(zhì)Brachet反應

當前第10頁\共有99頁\編于星期四\21點hematoxylin-eosin當前第11頁\共有99頁\編于星期四\21點B特異性染色

酶+底物

抗原+抗體+substrateantigenantibody************酶標記：免疫組織化學技術熒光標記：免疫熒光技術當前第12頁\共有99頁\編于星期四\21點3.熒光顯微鏡技術

(1)原理熒光分子在受到光照射后，可吸收特定波長的短波光線，并發(fā)射出比原來吸收波長更長的光

可見光紫外光紅外光shortlongλ

當前第13頁\共有99頁\編于星期四\21點（2）熒光顯微鏡的基本構造

A紫外光光源

B二向色鏡：反射短波光線，透過長波光線

C濾光片

當前第14頁\共有99頁\編于星期四\21點（3）常用的熒光染料

A有機染料熒光素羅丹明

FITC當前第15頁\共有99頁\編于星期四\21點B量子點quantumdotⅡ-Ⅵ族、Ⅲ-Ⅴ族元素構成的半導體納米結晶良好的光學穩(wěn)定性抗光漂白性當前第16頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第17頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第18頁\共有99頁\編于星期四\21點（4）應用

A免疫熒光顯微技術（Immunofluorescencemicroscopy）抗體+熒光染料

當前第19頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第20頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第21頁\共有99頁\編于星期四\21點B綠色熒光蛋白GFP

當前第22頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第23頁\共有99頁\編于星期四\21點4.相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）

(1)原理

波長顏色振幅

亮度速度

相位

當前第24頁\共有99頁\編于星期四\21點(2)應用

活體細胞觀察當前第25頁\共有99頁\編于星期四\21點5.激光掃描共焦顯微鏡（Laser

Scanning

ConfocalMicroscope）

(1)原理

在顯微鏡基礎上配置激光光源，掃描裝置，共軛聚焦裝置和檢測系統(tǒng)而形成的顯微鏡。單色激光光源光源后－照明針孔－點光源檢測器前－探測針孔分層掃描三維重建共扼當前第26頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第27頁\共有99頁\編于星期四\21點

（2）應用

A細胞的三維重建

B細胞定量熒光檢測

DNARNA蛋白質(zhì)含量

C細胞內(nèi)Ca2+pH動態(tài)檢測

D細胞間通訊當前第28頁\共有99頁\編于星期四\21點果蠅胚胎原腸胚當前第29頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第30頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第31頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第32頁\共有99頁\編于星期四\21點（二）電子顯微鏡技術

利用電子與固體樣品作用時所發(fā)出的信息,

對樣品進行微區(qū)觀察和分析的技術亞顯微結構超微結構

1.電子顯微鏡的特點

高分辨率

理論上

d=0.002nm

實際上

d=0.1nm

生物標本

d=2nm

高放大倍率

1,000,000

當前第33頁\共有99頁\編于星期四\21點陰極陽極聚光鏡（電磁透鏡）物鏡中間鏡投影鏡電鏡照片照相底片真空、上下顛倒

2.透射電子顯微鏡（Transmissionelectronmicroscope,TEM）

(1)基本構造

當前第34頁\共有99頁\編于星期四\21點(2)超薄切片的制備

A固定戊二醛:蛋白質(zhì)鋨酸:C=C(膜結構)

當前第35頁\共有99頁\編于星期四\21點B脫水上升梯度

乙醇：30%50%70%80%90%95%100%C包埋

單體樹脂加溫聚合

D切片

500–700?

E

重金屬染色

U(醋酸雙氧鈾)Pb(檸檬酸鉛)

當前第36頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第37頁\共有99頁\編于星期四\21點NADP酶反應嗜鋨反應TPP酶反應當前第38頁\共有99頁\編于星期四\21點2.掃描電子顯微鏡

（Scanningelectronmicroscopy,SEM）當前第39頁\共有99頁\編于星期四\21點(1)原理

二次電子(2)分辨率

3-10nm(3)樣品的制備

A固定

B脫水

C干燥臨界點干燥

D染色AuPt當前第40頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第41頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第42頁\共有99頁\編于星期四\21點透射電鏡利用穿透標本的電子進行成像(散射)觀察組織的二維切片掃描電鏡利用標本表面發(fā)射的二次電子成像觀察組織的表面三維結構當前第43頁\共有99頁\編于星期四\21點（三）掃描探針顯微鏡

（Scanningprobemicroscope,SPM）1.掃描隧道顯微鏡

使用原子尺度的探針在標本表面掃描，在探針針尖和樣品之間施加一定電壓，產(chǎn)生隨標本表面形貌變化的隧道電流。

分辨率高

可在非真空狀態(tài)下工作

直接觀察大分子的三維結構當前第44頁\共有99頁\編于星期四\21點2.原子力顯微鏡

通過分析探針針尖與樣品之間的原子間作用力來獲取所觀察表面的微觀信息。

樣品無需具有導電性

可在三態(tài)下工作

活細胞表面及生物大分子空間伸展及其結晶體表面觀測當前第45頁\共有99頁\編于星期四\21點二、細胞分離技術（cellseparation）從活體組織獲得相對單一類型的細胞群的方法

1.制備單一細胞懸液

組織

單一細胞消化EDTA

細胞間連接胰酶

細胞外基質(zhì)當前第46頁\共有99頁\編于星期四\21點二、細胞分離技術（cellseparation）從活體組織獲得相對單一類型的細胞群的方法

1.制備單一細胞懸液

組織

單一細胞消化EDTA

細胞間連接胰酶

細胞外基質(zhì)當前第47頁\共有99頁\編于星期四\21點2.分離不同類型細胞

(1)

離心（centrifugation）

大小密度形狀

小輕不規(guī)則

大重圓形當前第48頁\共有99頁\編于星期四\21點(2)免疫磁珠法

利用帶有特定單抗的免疫磁珠與靶細胞的特異結合，快速地從多細胞懸液中將目的細胞分離出來。

Fe2O3或Fe3O4顆粒

+

單克隆抗體免疫磁珠當前第49頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第50頁\共有99頁\編于星期四\21點(3)

流式細胞儀(flowcytometry)

能夠快速分選或檢測細胞及其組分的物理或化學特性的技術

A原理:

抗原+抗體*熒光標記

B樣品制備

細胞懸液制備細胞固定細胞染色當前第51頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第52頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第53頁\共有99頁\編于星期四\21點

B應用*細胞分選

cellin10005000cells/sec*細胞大小測量*DNA含量測定*免疫表型分析*細胞功能分析*細胞凋亡研究當前第54頁\共有99頁\編于星期四\21點細胞周期分析當前第55頁\共有99頁\編于星期四\21點

藥物處理前后HT29細胞的流式細胞分析結果

G0/G160.86%S29.14%G210.00%G0/G137.68%S37.56%G224.76%AB當前第56頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第57頁\共有99頁\編于星期四\21點

ND-1-QD605標記不同大腸癌細胞的流式細胞定量分析當前第58頁\共有99頁\編于星期四\21點(4)激光捕獲顯微切割技術（Lasercapturemicrodissection，LCM）從組織切片中精確分離獲取單一細胞的方法

當前第59頁\共有99頁\編于星期四\21點工作原理及過程:A制備組織切片B鏡下將組織切片覆以薄膜C激光束切割特定細胞或區(qū)域D收集管收集

當前第60頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第61頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第62頁\共有99頁\編于星期四\21點三、細胞培養(yǎng)技術（Cellculture）

從活體組織中分離出特定的細胞，在一定的條件下進行培養(yǎng)，使之能夠繼續(xù)生存、生長以至增殖的方法

invitro用培養(yǎng)細胞做實驗

invivo用動物做實驗當前第63頁\共有99頁\編于星期四\21點1.細胞培養(yǎng)的條件

(1)

固體表面：培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿

(2)培養(yǎng)基常見培養(yǎng)基：1640DMEM

當前第64頁\共有99頁\編于星期四\21點

(3)無菌無菌操作：超凈工作臺、火焰消毒等培養(yǎng)液中加入抗菌素器械、溶液消毒（烤箱、高壓滅菌、過濾）

(4)其他溫度37℃

濕度100%CO2濃度5%當前第65頁\共有99頁\編于星期四\21點2.細胞培養(yǎng)的傳代

原代培養(yǎng):直接取材于有機體的細胞培養(yǎng)取材切割消化培養(yǎng)

傳代培養(yǎng):將原代培養(yǎng)存活的細胞從培養(yǎng)瓶中取出，以1:2以上的比例擴大培養(yǎng)

原代培養(yǎng)

傳代培養(yǎng)(保持分化特性)

傳代當前第66頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第67頁\共有99頁\編于星期四\21點3.細胞系（Cellline）

在細胞培養(yǎng)中，偶然情況下產(chǎn)生的具有無限繁殖能力，能夠無限傳代的細胞群。

變異細胞

細胞系

HeLa人宮頸癌上皮細胞

3T3小鼠成纖維細胞無限繁殖當前第68頁\共有99頁\編于星期四\21點相差顯微鏡觀察培養(yǎng)中的HeLa細胞當前第69頁\共有99頁\編于星期四\21點4.細胞融合（Cellfusion）

（1）定義在自然或人工條件下，使二個或二個以上細胞合并形成一個細胞的過程。異核體雜交細胞分裂當前第70頁\共有99頁\編于星期四\21點（2）促融方法生物學方法：仙臺病毒化學方法：PEG

物理方法：電脈沖打孔儀（3）應用

A細胞核和細胞質(zhì)間的相互作用

B膜蛋白的流動性當前第71頁\共有99頁\編于星期四\21點C

基因定位D

單克隆抗體制備

B淋巴細胞腫瘤細胞MousecellHumancelldivision當前第72頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第73頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第74頁\共有99頁\編于星期四\21點E細胞周期相關因子的發(fā)現(xiàn)當前第75頁\共有99頁\編于星期四\21點四、細胞組分的分級分離通過逐級分離對細胞內(nèi)細胞器和各種成分的化學性質(zhì)和功能進行研究的方法。勻漿分級分離分析

當前第76頁\共有99頁\編于星期四\21點勻漿液膜細胞器大分子

低滲超聲去污劑強制過濾研磨

細胞破壞當前第77頁\共有99頁\編于星期四\21點（一）離心法用于分離細胞器和大分子

配平低溫當前第78頁\共有99頁\編于星期四\21點

1.差速離心法

分離對象:不同大小和形狀的組分

（細胞核、細胞器）

具體方法:由低速到高速逐級沉降(repeat)當前第79頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第80頁\共有99頁\編于星期四\21點2.速度沉降法

分離對象:不同大小、形狀的組分(沉降系數(shù)S)

比差速離心方法更精細

具體方法:

在離心管中予裝5%-20%蔗糖梯度的離心介質(zhì)

當前第81頁\共有99頁\編于星期四\21點3.平衡沉降法

分離對象:密度不同的組分（與大小、形狀無關）

具體方法：在離心管中予裝一定密度梯度的離心介質(zhì)（20%-70%蔗糖、CsCl）通常采用超速離心

當前第82頁\共有99頁\編于星期四\21點

（二）層析法（柱層析）主要用于分離、純化蛋白質(zhì)

填充柱填料（固定相）流動相當前第83頁\共有99頁\編于星期四\21點

1.離子交換層析

層析介質(zhì):陰離子或陽離子樹脂

分離原理:電荷

當前第84頁\共有99頁\編于星期四\21點

2.凝膠過濾層析層析介質(zhì):凝膠分離原理:分子大小

當前第85頁\共有99頁\編于星期四\21點3.親和層析

層析介質(zhì):

基質(zhì)+抗體底物

分離原理:

親和性當前第86頁\共有99頁\編于星期四\21點當前第87頁\共有99頁\編于星期四\21點4.高壓液相層析HPLC

基質(zhì)粒度?。?-10μm）、分辨率高、分離速度快

當前第88頁\共有99頁\編于星期四\21點(三)電泳法

主要用于分離蛋白質(zhì)、核酸

1.瓊脂糖凝膠電泳

分離對象:核酸

支持介質(zhì):瓊脂糖

凝固點40-45℃

不同濃度凝膠具有不同孔徑

電泳緩沖液:TAE\TBE

染料:溴化乙錠EB當前第89頁\共有99頁\編于星期四\21點(三)電泳法

主要用于分離蛋白質(zhì)、核酸

1.瓊脂糖凝膠電泳

分離對象:核酸

支持介質(zhì):瓊脂糖

凝固點40-45