第一章新藥評價內(nèi)容(一)藥學(xué)研究與評價(二)臨床前藥理研究(三)臨床前毒理學(xué)研究(四）臨床研究與評價第1頁/共166頁(一)藥學(xué)研究與評價名稱結(jié)構(gòu)或組份理化性質(zhì)原料藥生產(chǎn)工藝制劑處方及工藝定性鑒別含量測定雜質(zhì)檢查原料藥和制劑的穩(wěn)定性質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案和起草說明包裝材料和容器的選擇依據(jù)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)第2頁/共166頁(二)藥理研究主要藥效學(xué)二種模型量效關(guān)系指標(biāo)客觀陽性對照空白對照時效關(guān)系臨床給藥途徑二種動物體外試驗至少重復(fù)3次作用機理(全新藥)第3頁/共166頁(三)毒理學(xué)研究一般藥理三個劑量臨床途徑時效變化神經(jīng)系統(tǒng)心血管系統(tǒng)呼吸系統(tǒng)藥代動力學(xué)三個劑量二種動物臨床途徑8～12個采樣點藥動學(xué)基本參數(shù)方法學(xué)考證分布排泄急性毒性毒性癥狀LD50，二種動物二種途徑長期毒性三個劑量臨床途徑空白對照，動態(tài)觀察中毒癥狀中毒劑量動物選擇指標(biāo)測定二種動物靶器官安全劑量毒性性質(zhì)病理描述病理照片統(tǒng)計處理毒代動力學(xué)三個劑量6-8點主要毒代參數(shù)AUCCmaxTmax特殊毒性遺傳生殖致癌性局部毒性過敏刺激光毒溶血免疫毒性

(生物制品)依賴性作用于CNS藥物第4頁/共166頁第二章、毒理學(xué)研究

一、毒理學(xué)研究的意義二、毒理學(xué)研究的內(nèi)容及方法三、急性毒性研究四、長期毒性研究五、其他毒性研究六、特殊毒性研究七、毒代動力學(xué)研究第5頁/共166頁一、毒理學(xué)研究的意義1、毒理學(xué)研究簡介2、創(chuàng)新藥物的基本要求3、20世紀(jì)重大藥害事件4、已審批藥物的副作用與從市場撤出舉例5、安全性因素對藥物研發(fā)的影響第6頁/共166頁

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致癌性遺傳毒性

生殖毒性

局部耐受性、過敏、依賴性、免疫毒性光敏和其它試驗等

了解毒性反應(yīng)劑量、時間、強度、癥狀、靶器官及可逆性等，為臨床方案提供參考、預(yù)測出現(xiàn)的毒性反應(yīng)，制訂臨床防護措施、保證受試者用藥安全

毒理學(xué)研究局部用藥毒性全身用藥毒性發(fā)現(xiàn)毒理學(xué)一般毒性特殊毒性目的第7頁/共166頁2.創(chuàng)新藥物的基本要求

質(zhì)控安全有效

藥物的基本屬性（安全性、有效性、穩(wěn)定性、可控性），在一定意義上，由藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)所決定藥物分子設(shè)計是實現(xiàn)新藥創(chuàng)制的主要途徑和手段穩(wěn)定第8頁/共166頁3、20世紀(jì)重大藥害事件甘汞：

汞中毒死亡585人醋酸鉈：

鉈中毒死亡1萬人氨基比林：

粒細(xì)胞缺乏癥死亡2082人磺胺酏：

肝腎損害死亡107人非那西?。?/p>

腎損害、溶血死亡500人碘二乙基錫：神經(jīng)毒性、腦炎、失明死亡110人反應(yīng)停：

海豹樣畸形兒10000多死亡5000人異丙腎氣霧劑：嚴(yán)重心律失常、心衰，死亡3500人氯碘喹啉：

骨髓變性、失明、受害7856人，死亡5%心得寧：

眼-皮膚-粘膜綜合征，受害2257人第9頁/共166頁4、已審批藥物的副作用與從市場撤出舉例（1990-）年份藥物適應(yīng)癥/分類副作用1991Enkald恩卡尼上市４年抗心律失常藥物作用于心血管，突然死亡1992Temafloxacin替馬沙星抗菌類藥腎損傷1998Poslcor(mibefradll)

Duract(bronfenacsodium)降血壓藥/鈣通道抑制劑止痛藥致死性相互作用（抑制肝酶）肝損傷1999Tronan嚴(yán)格限制使用RaxarHismanal息斯敏Rotashield抗生素喹諾酮抗生素抗組胺藥輪狀病毒疫苗肝/腎損傷QT間期延長（致死）藥物相互作用腸梗阻2000RenzulinPropulsidLotonex治療Ⅱ型糖尿病藥燒心過敏性胃腸綜合癥肝損傷心律不齊/致死缺血性結(jié)腸炎2001Phenylpropanolaminebaychlor調(diào)節(jié)血脂藥降低膽固醇出血性休克橫紋肌溶解/致死第10頁/共166頁5、安全性因素對藥物研發(fā)的影響藥物撤出市場的原因總撤出的百分率人體藥代試驗不恰當(dāng)39臨床缺乏療效30動物毒性試驗11人體副作用10經(jīng)濟因素5其他5第11頁/共166頁二、毒理學(xué)研究的內(nèi)容及方法1、GLP－國際上安全性研究實驗室共同遵循的規(guī)范2、臨床前藥物安全性評價的主要內(nèi)容3、新藥臨床前安全性評價的利弊權(quán)衡4、新藥臨床安全性再評價的目的5、新藥臨床試驗安全性評價的局限性6、2007年10大藥物不良反應(yīng)事件回顧7、藥物臨床安全性再評價主要內(nèi)容8、新藥臨床階段安全性評價利弊權(quán)衡9、藥物上市后再評價的目的10、藥物上市后風(fēng)險的主要來源11、藥物的毒副作用與從市場撤出舉例第12頁/共166頁1、GLP－國際上安全性研究實驗室共同遵循的規(guī)范

提高藥品非臨床研究的質(zhì)量；確保實驗資料的真實性、完整性和可靠性；提高科學(xué)數(shù)據(jù)的質(zhì)量和有效性，促進實驗數(shù)據(jù)的國家間相互認(rèn)可；保證人民用藥安全，為人類健康服務(wù)。第13頁/共166頁2、臨床前藥物安全性評價的主要內(nèi)容單次給藥毒性試驗（急性毒性試驗）重復(fù)給藥毒性試驗（長期毒性試驗）遺傳毒性試驗生殖毒性試驗安全性藥理學(xué)試驗（一般藥理學(xué)）致癌性試驗藥物依賴性試驗特殊毒性試驗（過敏性、局部刺激性、溶血性）等免疫原性試驗毒代動力學(xué)實驗第14頁/共166頁臨床前研究結(jié)果評估：利－是指藥效或療效，弊－是指毒性或毒副作用毒性特點：（主要癥狀、毒性大小、靶器官、可逆性）安全范圍：（LD50/ED50、LOAEL、NOAEL）LOAEL(lowest-observed-adverse-effect-level)出現(xiàn)副反應(yīng)的最小劑量NOAEL（NoObservedAdverseEffectLevel）無可見有害作用水平同類藥比較：了解程度及優(yōu)勢（有效性和安全性）適應(yīng)癥背景：治療譜、毒性大?。ò踩秶?、性質(zhì)和早期可預(yù)測性人體相關(guān)性：注意量化（毒代暴露量）利弊權(quán)衡－是一個綜合性的評價過程（系統(tǒng)工程）3、新藥臨床前安全性評價的利弊權(quán)衡第15頁/共166頁4、新藥臨床安全性再評價的目的臨床前研究結(jié)果并不能完全推測臨床研究結(jié)果，動物模型也不能完全復(fù)制出人體發(fā)生的疾病。臨床中存在聯(lián)合用藥產(chǎn)生藥物相互作用問題。藥物在臨床使用中發(fā)現(xiàn)毒副作用，需進行毒性機制研究尋找解毒藥物。部分試驗可以在藥物進行臨床研究中才開始進行。臨床研究中有時會出現(xiàn)藥物引起的特異質(zhì)毒性反應(yīng)。特需藥品免做臨床前安全性評價研究的藥物。第16頁/共166頁藥品上市前動物毒性研究的局限性藥品上市前人體臨床試驗倫理范圍的局限性藥品上市前人體臨床試驗科學(xué)性研究的局限性統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在所有的藥物臨床試驗與應(yīng)用中，不良反應(yīng)種類出現(xiàn)的概率是：在一般動物毒性試驗中只占３５％左右；在Ⅰ期人體耐受試驗中只有２０％；在Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗的出現(xiàn)率是３５％；在Ⅳ期臨床試驗時出現(xiàn)７０％；到市場銷售時全部副作用才陸續(xù)出現(xiàn)。

5、新藥臨床試驗安全性評價的局限性

第17頁/共166頁6、2007年10大藥物不良反應(yīng)事件回顧頭孢曲松鈉的安全使用問題（與鈣使用，嬰兒死亡）靜脈輸注人免疫球蛋白引起丙肝抗體陽性率增加甲磺酸培高利特撤市（心臟瓣膜病）

馬來酸替加色羅撤市(心肌梗死、腦卒中）含釓造影劑的安全問題（腎源性纖維化?。┝_格列酮的安全性受質(zhì)疑（心梗和心源性死亡）注射用甲氨蝶呤、阿糖胞苷中混入長春新堿（N受損）感冒藥禁用于2歲或以下兒童（死亡）哺乳婦女服用可待因可能導(dǎo)致嬰兒發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)硫酸普羅寧與胸腺肽注射劑可引起嚴(yán)重不良反應(yīng)

第18頁/共166頁7、藥物臨床安全性再評價主要內(nèi)容藥物毒性作用靶器官、藥物毒性作用模型的研究解決由于模型不合適而發(fā)生的不良反應(yīng)，重新設(shè)計動物模型評價藥物的毒性作用藥物毒性作用機制

解決小概率毒性作用藥物的不良反應(yīng)，評價沒有動物模型不良反應(yīng)藥物的毒性作用聯(lián)合用藥的作用機制篩選研究解決臨床上由于聯(lián)合用藥而發(fā)生的不良反應(yīng)根據(jù)新藥特點，可在臨床階段提供新藥安全性資料

致突變試驗、致癌性試驗和III段生殖試驗，一般可以在申報NDA時提供其研究資料

第19頁/共166頁8、新藥臨床階段安全性評價利弊權(quán)衡評估臨床已出現(xiàn)的毒性，和毒性特點以及監(jiān)測、防治措施。確定進一步臨床和劑量選擇方案提供重要信息。綜合相關(guān)信息進行利弊權(quán)衡，判斷能否向臨床推進。根據(jù)毒理結(jié)果調(diào)整臨床適應(yīng)癥范圍、適應(yīng)人群或給藥方案綜合比較新藥與已上市藥物之間毒副作用與安全性之間的關(guān)系，分析與判斷該新藥上市的可能性。第20頁/共166頁9、藥物上市后再評價的目的新藥上市前安全性評價的局限性病例太少、研究時間太短、試驗對象年齡范圍太窄、用藥對象條件控制太嚴(yán)藥物副反應(yīng)與安全性的關(guān)系

副作用、變態(tài)反應(yīng)、特異質(zhì)反應(yīng)、藥物依賴性、致癌、致突變、致畸作用老藥的毒、副作用研發(fā)成新藥的可能性

反應(yīng)停、長春新堿、阿托品、阿斯匹林、雌激素藥物再評價與藥物命運的關(guān)系

限制與撤出使用、醫(yī)療事故判斷的依據(jù)第21頁/共166頁10.藥物上市后風(fēng)險的主要來源已知風(fēng)險可避免的無法避免的藥品缺陷仿冒制品可預(yù)防的AEs損傷或死亡其他的不確定因素潛在的、未知的風(fēng)險缺失信息，如人種、年齡、性別、藥物與藥物之間、藥物與疾病之間的相互作用等。不同的問題，應(yīng)給予相應(yīng)的解決方法－上市后監(jiān)測與安全性再評價用藥錯誤第22頁/共166頁11.藥物的毒副作用與從市場撤出舉例（1990-）年份藥物適應(yīng)癥/分類副作用1991Enkald恩卡尼上市４年抗心律失常藥物作用于心血管，突然死亡1992Temafloxacin替馬沙星抗菌類藥腎損傷1998Poslcor(mibefradll)

Duract(bronfenacsodium)

降血壓藥/鈣通道抑制劑止痛藥致死性相互作用（抑制肝酶）肝損傷1999Tronan嚴(yán)格限制使用Raxar格帕沙星(Grepafloxacin)

Hismanal息斯敏Rotashield輪狀病毒疫苗

抗生素喹諾酮抗生素抗組胺藥輪狀病毒疫苗肝/腎損傷QT間期延長（致死）藥物相互作用腸梗阻2000RenzulinPropulsidLotonex治療Ⅱ型糖尿病藥燒心過敏性胃腸綜合癥肝損傷心律不齊/致死缺血性結(jié)腸炎2001Phenylpropanolaminebaychlor調(diào)節(jié)血脂藥降低膽固醇出血性休克橫紋肌溶解/致死第23頁/共166頁12.非臨床安全性評價基本原則

把握藥理毒理評價的系統(tǒng)性充分暴露毒性具體問題具體分析執(zhí)行GLP（藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范）第24頁/共166頁13.非臨床安全性評價全過程

質(zhì)量管理GRP-GoodReviewingPracticeGSP-GoodSupplyPracticeGUP-GoodUsingPracticeGSSP-GoodStorageAndShippingPracticeGMP-GoodManufacturingPracticeGLP-GoodLaborataryPracticeGCP-GoodClinicalPractice藥物相關(guān)的GXP管理GCP/GLP藥品研制藥品生產(chǎn)GMPGSP藥品流通GUP藥品使用藥品審評GRP藥物儲存GSSP第25頁/共166頁14、藥物安全性評價最終目的－為臨床服務(wù)初步目的–

毒理試驗本身（試驗評價）1.毒性反應(yīng)（定性和定量）劑量、時間、程度、癥狀、性質(zhì)、靶器官以及損傷的可逆性2.安全劑量及安全范圍最終目的—向臨床過渡（綜合評價）申報臨床：1.預(yù)測人臨床用藥時的可能毒性，以制定監(jiān)測、防治措施2.推算臨床研究的安全參考劑量和安全范圍，進行利弊權(quán)衡申報生產(chǎn)：3.為說明書提供信息--尤其是那些無法在人體試驗的動物結(jié)果，限制用藥人群，幫助利弊權(quán)衡。第26頁/共166頁21/24/26號:過敏性（局部、全身和光敏毒性）、／溶血性和局部（血管、皮膚、粘膜、肌肉等）刺激性等主要與局部、全身給藥有關(guān)的特殊安全性試驗研究和文獻資料22//27號:復(fù)方制劑中多種成/組份藥效、毒性、藥代動力學(xué)相互影響的試驗資料及文獻資料23/25/22號:致突變試驗資料及文獻資料24/26/23號:生殖毒性試驗資料及文獻資料25/27/24號:致癌試驗資料及文獻資料26//28號:依賴性試驗資料及文獻資料27/28/21號:動物藥代動力學(xué)試驗資料及文獻資料15、各類新藥申報資料的一般要求第27頁/共166頁16、《藥品注冊管理辦法》藥品注冊藥理毒理申報資料藥理毒理研究資料綜述主要藥效學(xué)試驗資料及文獻資料一般藥理學(xué)的試驗資料及文獻資料－（ＧＬＰ）急性毒性試驗資料及文獻資料－（ＧＬＰ）長期毒性試驗資料及文獻資料－（ＧＬＰ）過敏性（局部、全身、和光敏毒性）、溶血性和局部（血管、皮膚、粘膜、肌肉等）刺激性等特殊安全性試驗資料和文獻資料－（ＧＬＰ）復(fù)方制劑中多種成分藥效、毒性、藥代動力學(xué)相互影響的試驗資料和文獻資料致突變試驗資料及文獻資料－（ＧＬＰ）生殖毒性試驗資料及文獻資料－（ＧＬＰ）致癌試驗資料及文獻資料－（ＧＬＰ）依賴性試驗資料及文獻資料－（ＧＬＰ）非臨床藥代動力學(xué)試驗資料及文獻資料－（ＧＬＰ）第28頁/共166頁

17.臨床前安全性評價

與臨床的差別

研究方案/種屬動物人體個體數(shù)量大量個體個體年齡青年各個年齡段個體健康狀況健康不定個體遺傳背景同源異源給藥劑量從治療量到中毒量治療量給藥時間通常每日一次根據(jù)治療需要居住條件統(tǒng)一，最佳不定營養(yǎng)統(tǒng)一，最佳不定輔助治療無經(jīng)常語言交流無廣泛病理組織學(xué)全面特例第29頁/共166頁

18、長期毒性試驗的給藥期限藥物臨床療程長期毒性試驗給藥期限可以支持的臨床研究階段嚙齒類動物非嚙齒類動物單次給藥2周2周Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期≤2周1個月1個月Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期>2周*1個月1個月Ⅰ期≤1個月1個月1個月Ⅱ期3個月3個月Ⅲ期≤3個月3個月3個月Ⅱ期6個月6個月Ⅲ期≤6個月6個月6個月Ⅱ期6個月9個月Ⅲ期>6個月6個月9個月Ⅱ期6個月9個月Ⅲ期第30頁/共166頁19.安評資料審評中的主要問題

（一）受試物（二）試驗動物（三）給藥途徑（四）給藥頻率（五）給藥期限（六）給藥劑量（七）觀察指標(biāo)（八）觀察指標(biāo)的時間和次數(shù)（九）結(jié)果及分析（十）綜合評價第31頁/共166頁

急性（單次給藥）毒性長期（重復(fù)給藥）毒性致突變（遺傳毒性）生殖毒性致癌性免疫原性依賴性毒代動力學(xué)其它毒性（過敏性、溶血性、光毒性、免疫毒性、藥物依賴性等試驗）20、藥物安全性評價研究的范圍第32頁/共166頁

受試藥物化學(xué)藥品：原料、制劑生物制品：制劑中藥：原料、制劑、浸膏試驗動物

動物同藥效試驗嚙齒類和非嚙齒類兩種，如大鼠、犬或猴等。理由充分，一種相關(guān)動物21.藥物非臨床研究-共性問題第33頁/共166頁22.臨床前毒理學(xué)評價總的要求找出毒性劑量Toxicdosage確定安全劑量范圍

Safetymargin

毒性反應(yīng)Toxicreaction:性質(zhì)、程度、量毒關(guān)系、產(chǎn)生時間，達峰時間,

持續(xù)時間及反復(fù)產(chǎn)生毒性反應(yīng)時間、遲發(fā)性、蓄積性、耐受性

尋找毒性反應(yīng)靶器官TargetOrgan

毒性反應(yīng)是否可逆Reversibility確保臨床用藥安全第34頁/共166頁（一）試驗要求（二）目的意義（三）基本內(nèi)容和要求（四）急性毒性LD50常用計算方法（五）有關(guān)問題三、急性毒性試驗第35頁/共166頁（一）試驗要求試驗動物嚙齒類----小鼠或大鼠非嚙齒類----犬或其它一類藥至少必須用二種動物(嚙齒類及非嚙齒類各一種,其中非嚙齒類宜用Beagle犬);其它類酌情用二種動物小鼠18-22g,同次體重相差不超過4g;大鼠120-150g,同次體重不超過20g;犬用成年犬♀♂各半

第36頁/共166頁（二）急性毒性試驗?zāi)康囊饬x1、了解新藥急性毒性強度2、計算新藥相對毒性參數(shù)3、為臨床毒副反應(yīng)監(jiān)護提供參考依據(jù)4、為長期毒性、蓄積性毒性提供依據(jù)5、為特殊毒性試驗選擇劑量提供依據(jù)6、其它方面第37頁/共166頁1、新藥急性毒性的強度

表.化學(xué)物質(zhì)的急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)(WHO,1977)━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━毒性分級ig大、小鼠LD50吸入大、小鼠LC50涂皮兔LD50人口服可能的

(mg/kg)(ppm)(mg/kg)致死量(g)━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━極毒<1<10<50.06劇毒1-5010-1005-444中等毒51-500101-100045-35030低毒501-50001001-10000351-2180250實際無毒>5000>10000>2180>1200━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━*吸入毒性LC50指中毒欄中的濃度,一次中毒2-4小時,觀察24天

第38頁/共166頁新藥急性毒性的強度

表.歐共體對化學(xué)物的毒性分級━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━動物及給藥途徑劇毒毒有害━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━大鼠LD50ig(mg/kg)≤2525-200200-2000大鼠或兔經(jīng)皮LD50(mg/kg)≤5050-400400-2000大鼠LC50(mg/L/4h≤0.50.2-22-20━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

第39頁/共166頁2、相對毒性參數(shù)治療指數(shù)TI=LD50/ED50安全系數(shù)SF=LD5/ED95可靠或確實安全系數(shù)CSF=LD1/ED99安全范圍SM=(LD1/ED99-1)X100%SED50/ED50,越大越安全LD5基本無害量ED95基本有效量LD1肯定無害量

ED99肯定有效量第40頁/共166頁3.為臨床毒副反應(yīng)監(jiān)護提供參考中毒癥狀起始時間持續(xù)時間恢復(fù)時間對抗試驗為臨床急救提供依據(jù)第41頁/共166頁急性毒性試驗觀察動物反應(yīng)指標(biāo)中毒部位毒性癥狀表現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)呆滯:對刺激反應(yīng)遲緩、減弱、消失；不安：對刺激反應(yīng)過敏、興奮；強直：行動姿勢改變、叫聲異常、震顫、共濟失調(diào)植物神經(jīng)系統(tǒng)瞳孔縮小、放大;分泌增多，如流涎、流淚呼吸系統(tǒng)鼻孔流鼻涕、呼吸緩慢、困難、潮式呼吸、速率加快等心血管系統(tǒng)心動過速、緩慢、心律不齊、心跳過強、微弱胃腸系統(tǒng)脹、腹瀉、便秘、糞便不成形、糞便黑色生殖系統(tǒng)乳腺膨脹、會陰部污濁、陰囊下垂等皮膚、毛皮膚發(fā)紅、松弛、皮疹、毛豎起粘膜口腔流粘液、充血、潰瘍、出血性紫紺眼睛上瞼下垂、眼球突出混濁其他直腸溫度升高、降低；消瘦；拒食等第42頁/共166頁4、為長毒、蓄毒試驗

選擇劑量提供依據(jù)長期毒性劑量設(shè)計LD50法(1/10,1/50,1/100)MTD法(1,1/3,1/10)蓄積性毒性劑量設(shè)計1/10LD50,然后按等比級數(shù)1.5倍逐漸遞增第43頁/共166頁5、為特殊毒性試驗選擇劑量提供依據(jù)生殖毒性試驗高劑量為母鼠MTD致突變試驗嚙齒類動物微核試驗高劑量為1/2LD50果蠅伴性隱性致死試驗的高、低劑量分別為1/2LD50和1/4LD50精原細(xì)胞染色體畸變試驗高劑量應(yīng)為1/2LD50

動物短期致癌試驗高劑量應(yīng)是MTD主要藥效學(xué)劑量限度、一般藥理學(xué)和藥動學(xué)劑量設(shè)計也要參考急性毒性的LD50第44頁/共166頁6、其它方面系列化合物的合格率分析(除理化性質(zhì)為主外)也參考LD50復(fù)方中藥物的相互作用,有時也通過拆方及合用的LD50來判別相互作用的性質(zhì)第45頁/共166頁四、長期毒性試驗（一）目的意義（二）基本內(nèi)容和要求

1、LD50試驗

2、最大耐受量試驗

3、最大給藥量試驗

4、限量試驗（三）長期毒性研究目的（四）試驗方案設(shè)計

1-基本原則

2-試驗動物

3-給藥方案第46頁/共166頁（一）目的意義毒性劑量Toxicdosage安全范圍Safetymargin毒性反應(yīng)Toxicreaction:性質(zhì)、程度、量毒關(guān)系、產(chǎn)生時間，達峰時間,

持續(xù)時間及反復(fù)產(chǎn)生毒性反應(yīng)時間、遲發(fā)性、蓄積性、耐受性

毒性反應(yīng)靶器官Targetorgan

毒性反應(yīng)是否可逆Reversibility第47頁/共166頁1-LD50試驗指動物單次給藥后引起50％動物死亡的劑量。LD50值的意義是：LD50越小表示藥物的急性毒性越大。動物：小鼠、大鼠等動物與分組：一般5組；每組10只雌、雄各半。試驗前禁食給藥途徑：臨床給藥途徑觀察14天，進行大體解剖觀察，如有改變-病理檢查（二）基本內(nèi)容和要求第48頁/共166頁2-最大耐受量試驗

（MTD--Maximum-ToleratedDose

）指動物單次大劑量給藥或在24小時內(nèi)接受多次大劑量受試藥物后，動物在短期內(nèi)出現(xiàn)的與藥物相關(guān)的毒性反應(yīng)，但是又不引起動物死亡的最大劑量動物：小鼠、大鼠、犬等動物數(shù)：小動物20只；大動物4只雌、雄各半。試驗前動物應(yīng)注意禁食給藥途徑：臨床給藥途徑觀察14天，進行大體解剖觀察，如有改變-病理檢查（二）基本內(nèi)容和要求第49頁/共166頁

該試驗多用于中藥和毒性較小的其它藥物研究指藥物以最高濃度和最大容積的給藥，劑量可能并未達到最大耐受的劑量，所以該劑量被稱為最大給藥量。具體要求可參照最大耐受量試驗。

低毒藥物，口服給藥：5g（或ml）/kg

動物數(shù)一般≥5只，大鼠禁食一夜，小鼠禁食4－6小時，觀察14天，如無死亡，則無必要進行更高劑量如動物在5g/kg出現(xiàn)死亡，可選擇較低劑量3、最大給藥量試驗4、限量試驗（二）基本內(nèi)容和要求第50頁/共166頁觀察動物在給予超過臨床劑量（數(shù)倍或數(shù)十倍）和用藥周期（3-4倍以上）的情況下所出現(xiàn)的毒性反應(yīng)設(shè)法發(fā)現(xiàn)引起毒性反應(yīng)的劑量、劑量與毒性之間的關(guān)系、中毒表現(xiàn)和程度、主要毒性靶器官或組織及可逆程度等預(yù)測臨床研究階段可能的安全范圍和毒性，預(yù)先制定防治措施或避免某些有特殊疾病患者的使用，減少臨床可能的風(fēng)險為臨床試驗初始劑量和指標(biāo)的選擇等提供重要參數(shù)（三）長期毒性研究目的第51頁/共166頁通常長毒始于主要藥效、安全藥理、單次給藥毒性、初步藥代動力學(xué)（如果已經(jīng)可獲得）等試驗之后有些藥物側(cè)重比較毒理學(xué)的研究，如新的劑型、改變酸根或堿基、改變給藥途徑等。（四）試驗方案設(shè)計-基本原則第52頁/共166頁l

動物的種類

常用大鼠和犬或敏感動物。創(chuàng)新藥一般2種以上，雌雄各半。生物制品多用大鼠和猴（種屬特異性可特殊）

動物的年齡與數(shù)量

大鼠試驗3月內(nèi)：6-8周齡；>3月：5-6周齡犬：一般選用性成熟的，6-10月；猴：3.5-4.5年根據(jù)試驗周期長短確定每組動物數(shù)。原則：試驗結(jié)束時小動物每組動物數(shù)應(yīng)滿足統(tǒng)計學(xué)要求；大動物的數(shù)應(yīng)滿足毒理學(xué)評價要求；一般大鼠為10-30只，雌雄各半；犬、猴至少雌、雄各3只；毒性大、周期長數(shù)量應(yīng)增加，考慮恢復(fù)期數(shù)量。（四）試驗方案設(shè)計—實驗動物第53頁/共166頁給藥時間臨床給藥周期的3-4倍。反復(fù)、長期或植入的藥，按最長給藥時間，即嚙齒-6月；非嚙齒-9月周期短-每天給藥；>1個月-6天/周

-每天給藥時間應(yīng)一致

-保證動物攝入量的準(zhǔn)確性中藥如給藥體積大，可將藥物分成2次/日

-不提倡采用摻食給藥，除非有穩(wěn)定性、均一性（四）試驗方案設(shè)計—給藥方案第54頁/共166頁給藥劑量一般3個給藥劑量組高劑量-動物應(yīng)出現(xiàn)毒性和個別死亡（<20%）低劑量-等于或略高于有效劑量，無毒性中劑量-介于以上兩者之間，輕微毒性或者按急毒結(jié)果：

LD50法(1/10,1/50,1/100)MTD法(1,1/3,1/10)（四）試驗方案設(shè)計—給藥方案第55頁/共166頁對照組的設(shè)置

-通常給藥組和對照組的動物數(shù)應(yīng)基本相等

-對照組可根據(jù)試驗方案的具體要求和研究目的設(shè)立陰性對照組、溶媒對照組觀察指標(biāo)全面、針對特點一般體征、飲食、體重變化；血尿常規(guī)、血液及血液生化指標(biāo)、心電圖，臟器/體重系數(shù)、重要組織器官的肉眼和病理組織學(xué)觀察、死亡情況。應(yīng)記錄毒性癥狀出現(xiàn)、減輕或消失的時間。體重和進食量每周測1-2次。周期>3月的，1/3動物檢查中期主要指標(biāo)；如發(fā)現(xiàn)異?？蛇m當(dāng)增加檢查次數(shù)。（四）試驗方案設(shè)計—給藥方案第56頁/共166頁五、其他毒性研究1、致突變性試驗2、生殖毒性試驗3、致癌性試驗4、皮膚給藥急性毒性試驗5、皮膚給藥的長期毒性試驗6、皮膚刺激試驗7、皮膚過敏試驗8、光敏試驗9、眼刺激試驗10、滴鼻劑和吸入劑急性毒性試驗11、直腸、陰道用藥急毒試驗12、直腸、陰道用藥刺激試驗13、身體依賴性試驗-自然戒斷試驗14、身體依賴性試驗--替代試驗15、身體依賴性試驗--催促試驗16、身體依賴性試驗--誘導(dǎo)試驗17、精神依賴性試驗第57頁/共166頁

目前建立的遺傳毒性試驗是研究機體遺傳物質(zhì)受外源性化學(xué)物質(zhì)或其它環(huán)境因素作用時對有機體產(chǎn)生的遺傳毒性作用。遺傳毒性試驗包括體外和體內(nèi)檢測系統(tǒng)。兩者應(yīng)結(jié)合進行研究。體外檢測系統(tǒng)包括細(xì)菌回復(fù)突變、微核試驗、哺乳動物細(xì)胞染色體畸變等；體內(nèi)試驗包括骨髓微核試驗、顯性致死試驗等。一類藥需要提供實驗資料1、致突變性試驗（遺傳毒性）第58頁/共166頁

概念評價藥物對哺乳動物生殖的影響，推測對人可能的生殖毒性研究分為三段

I段（一般生殖毒性）：是評價對成年動物生育力和早期胚胎發(fā)育影響，評價藥物對配子成熟，交配行為、受孕、胚胎著床前和著床的影響

II段（致畸敏感期毒性）：即妊娠動物在胚胎器官形成期給藥，評價藥物對親體、胚胎、胎仔發(fā)育影響

III段（圍產(chǎn)期毒性）：在妊娠動物分娩前后給藥，評價胎仔出生前后的發(fā)育和孕鼠從妊娠后期至斷奶期間給藥對妊娠、分娩、哺乳、胚胎、胎仔發(fā)育的影響。根據(jù)臨床用藥次數(shù)、適應(yīng)證和擬用人群決定是否進行該試驗創(chuàng)新藥，一般可在申報臨床研究前先提供II段試驗對于可能只給一次或終身一次（如診斷或外科手術(shù)）的藥，重復(fù)給藥研究也許是不必要的。在較高劑量下，縮短處理期似乎更合適。2、生殖毒性試驗第59頁/共166頁致癌試驗檢測受試藥物對動物的潛在致瘤性藥物是否進行該試驗應(yīng)在獲得一定的相關(guān)信息后才能確定人群最長用藥的時間及遺傳毒理學(xué)、重復(fù)給藥毒性等相關(guān)結(jié)果重復(fù)給藥毒性試驗可能顯示受試藥物具有免疫抑制特性、激素活性或考慮對人類是一種危險因子時，都應(yīng)慎重考慮進行有關(guān)的致癌試驗。如：-藥物擬用于非腫瘤病人的輔助治療或非癌癥疾病的重復(fù)給藥使用

-臨床連續(xù)給藥時間大于6個月應(yīng)進行該試驗

-治療慢性和復(fù)發(fā)性疾病而經(jīng)常間斷使用藥物

-有明確遺傳毒性的化合物；

-其構(gòu)效關(guān)系提示有潛在的致癌性的藥物

-在連續(xù)重復(fù)給藥的毒性試驗中有癌前期病變的證據(jù)

-重復(fù)給藥滯留的母體化合物或其代謝產(chǎn)物導(dǎo)致局部組織或病生理改變

-較長時間接觸的藥物，如緩慢釋放藥物也應(yīng)考慮進行該試驗

-內(nèi)源性肽類、蛋白質(zhì)是否需要進行該研究需作特殊考慮-超生理水平3-1、致癌性試驗第60頁/共166頁

以下情況進行致癌試驗尤為重要：1）產(chǎn)生的生物學(xué)作用與天然產(chǎn)物明顯不同；2）由于修飾導(dǎo)致產(chǎn)品結(jié)構(gòu)與天然產(chǎn)物相比有明顯不同；3）在人體局部或全身的濃度（即藥理學(xué)水平）明顯增加。對于抗腫瘤藥物是否進行該試驗，可考慮以下因素：

-如果用藥人群的生存期較短（2－3年），則不要求

-如用于晚期全身治療的抗腫瘤藥物一般不需要進行，但當(dāng)該藥物療效較好，能明顯延長生命時，應(yīng)考慮有關(guān)繼發(fā)性腫瘤的問題，應(yīng)進行致癌性研究3-2、致癌性試驗第61頁/共166頁目的:觀察短期接觸受試物后皮膚的毒性反應(yīng)動物:家兔、豚鼠或大鼠，♀♂各半，家兔體重２kg,豚鼠300g,大鼠200g左右,給藥前24h將動物背部脊柱兩側(cè)毛脫掉,去毛范圍約相當(dāng)于體表面積的10%左右,(家兔約150cm2左右,豚鼠、大鼠約40cm2左右）藥物：膏劑、液體或粉末。粉末需用賦形劑（如羊毛脂、凡士林等）混勻，以保證受試物與皮膚有良好的接觸劑量：3個，組距0.65－0.85。家兔每組４只，豚鼠或大鼠每組10只并設(shè)賦形劑或空白對照組方法：將受試物均勻涂敷于脫毛區(qū)，破損皮膚則在脫毛區(qū)劃破皮膚后再涂敷受試物。24h后去除，每日觀察，連續(xù)7-14天。觀察動物體重、皮膚、毛發(fā)、眼睛和粘膜的變化，呼吸、循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動等變化。若有死亡則進行尸檢，當(dāng)有肉眼可見病變，則需進行病檢判斷：試驗結(jié)果與對照組比較判斷4、皮膚給藥急性毒性試驗

第62頁/共166頁5.皮膚給藥的長期毒性試驗?zāi)康模河^察經(jīng)皮滲透產(chǎn)生的異常反應(yīng)和可逆程度，找到靶器官動物：家兔(2kg,6只/組)，豚鼠(300g，10只/組)或大鼠(200g，10只/組)，♀♂各半。給藥前24h動物背部脊柱兩側(cè)脫毛，面積同急毒受試物：同急性毒性試驗劑量：３個，要求同大鼠口服長毒試驗，并設(shè)賦形劑或空白對照組，若用受試物劑量超過有效濃度20倍以上，仍未見動物有不良反應(yīng)或死亡時，則只須設(shè)一個高劑量組方法：受試物均勻涂敷,每次至少接觸６h，臨床用藥療程的３倍以上時間連續(xù)給藥。部分動物應(yīng)于停藥后繼續(xù)觀察１-２周，檢測指標(biāo)：除每日觀察皮膚、臨床變化及皮膚病理學(xué)檢查外，其血液學(xué)、血液生化指標(biāo)和病理學(xué)檢查項目同大鼠長期毒性試驗要求判斷：實驗結(jié)果應(yīng)寫明安全劑量、中毒劑量、中毒表現(xiàn)、中毒靶器官及中毒的可逆程度等第63頁/共166頁6、皮膚刺激試驗?zāi)康模河^察刺激反應(yīng)情況動物：首選家兔(2kg左右)，其次為豚鼠(300g左右)。藥前24h脫毛，家兔每側(cè)脫約50cm2，豚鼠每側(cè)脫約20cm2受試物：同急性毒性試驗方法：≥３只家兔或５只豚鼠，在受試物區(qū)、對照區(qū)和破損皮膚區(qū)（脫毛后），一次或多次將受試物１ml或1g涂于受試物區(qū)，賦形劑則涂于對照區(qū)。24h后去除。觀察1、24、48和72h涂抹部位有無紅斑和水腫等，變化的恢復(fù)情況和時間多次給藥則每日涂抹一次，連續(xù)一周，其余均與一次給受試物的方法和要求一致結(jié)果評價：每只動物試驗結(jié)果進行刺激反應(yīng)評分，計算出平均分值進行刺激強度評價第64頁/共166頁皮膚刺激反應(yīng)評分━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

刺激反應(yīng)分值━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━紅斑:

無紅斑0

勉強可見1

中度紅斑2

嚴(yán)重紅斑3

紫紅色紅斑并有焦痂形成4水腫:

無水腫0

勉強可見1

皮膚隆起輪廓清楚2

水腫隆起約1mm并范圍擴大4━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━第65頁/共166頁皮膚刺激強度評價━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

強度分值━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━無刺激性<0.5

輕度刺激性<2.0

中度刺激性<6.0

強度刺激性>6.0━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━第66頁/共166頁7、皮膚過敏試驗?zāi)康?觀察免疫系統(tǒng)反應(yīng)在皮膚上的表現(xiàn)動物：豚鼠♀♂各半(250-300g)。給藥前24h背部兩側(cè)脫毛，脫毛區(qū)每側(cè)約3x3cm2受試物：若受試物是膏劑或液體，直接試驗。若為固體粉末，則用水或賦形劑（如羊毛脂、凡士林、橄欖油等）混勻陽性致敏物：2,4-二硝基氯代苯配成1%的致敏濃度和0.1%的激發(fā)濃度方法：分受試物組，空白對照組，陽性對照組，每組10只（♀♂各半）1.致敏接觸：將受試物0.1-0.2ml(ｇ)涂在左側(cè)脫毛區(qū)，持續(xù)6h。第７天和第14天，同法各重復(fù)一次2.激發(fā)接觸：末次致敏后14天，將受試物0.1-0.2ml(ｇ)涂于右側(cè)脫毛區(qū)，陽性對照用0.1%2,4—二硝基氯代苯，６h后去除，即刻觀察，然后于24、48、72h再次觀察過敏反應(yīng)情況結(jié)果評價：結(jié)果按皮膚反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)評分，根據(jù)試驗組與對照組豚鼠皮膚反應(yīng)的差別，判斷受試物對皮膚過敏反應(yīng)性質(zhì)可用致敏率(紅斑或水腫的動物例數(shù)/受試動物總數(shù))判斷致敏強度第67頁/共166頁皮膚過敏反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)

皮膚反應(yīng)分值紅斑形成：無紅斑０輕度紅斑１中度紅斑２重度紅斑３水腫性紅斑４水腫形成：無水腫０輕度水腫１中度水腫２重度水腫３第68頁/共166頁致敏率分類━━━━━━━━━━━━━━━━━

致敏率（%）反應(yīng)強度━━━━━━━━━━━━━━━━━０－10弱致敏性性

20－30輕度致敏性

40－60中度致敏性

70－80高度致敏性

90－100極度致敏性━━━━━━━━━━━━━━第69頁/共166頁8、光敏試驗有些受試物皮膚涂抹后遇光照可引起光敏反應(yīng)若其化學(xué)結(jié)構(gòu)或某些組成（包括藥物和賦形劑）文獻報導(dǎo)有光敏作用者應(yīng)作光敏試驗其化學(xué)結(jié)構(gòu)和已知光敏劑相似者也應(yīng)做光敏試驗第70頁/共166頁皮膚給藥毒性試驗有關(guān)問題設(shè)立賦形劑對照組，賦形劑各種指標(biāo)、規(guī)格等均應(yīng)符合藥用規(guī)格受損皮膚的用藥，急毒、長毒等毒性試驗也宜以模擬破損皮膚進行高劑量符合制劑工藝要求，以劑型允許配制濃度和允許給藥容量給藥。不能將外用藥厚厚地涂在皮膚上第71頁/共166頁9眼刺激試驗?zāi)康模河^察眼睛接觸受試物后產(chǎn)生的刺激反應(yīng)動物：家兔≥４只，體重2－3kg受試物：液體或膏劑均可直接滴入或涂敷劑量：用原液或原膏劑，不必稀釋，每只眼睛滴入0.1ml或涂敷0.1g以內(nèi)方法：滴入或涂敷于動物一側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)，另一側(cè)作為空白（或賦形劑）對照。給藥后使眼睛被動閉合5－10分。記錄給藥后6、24、48、72h至7天眼的局部反應(yīng)情況臨床用藥超過一周的受試物要進行多次給藥刺激試驗，連續(xù)給藥一周以上結(jié)果評價：將每只動物的眼角膜、虹膜和結(jié)膜的刺激反應(yīng)的分值相加，即是一只受試動物眼刺激反應(yīng)的總積分。把每個受試動物的刺激反應(yīng)積分的總和除以動物數(shù)，就是該受試物對眼刺激性的最后分值，以此判定受試物刺激程度第72頁/共166頁9眼刺激試驗

眼刺激試驗--角膜評分無混濁０散在或彌漫性混濁，虹膜清晰可見1

半透明區(qū)易分辨，虹膜模糊不清2

出現(xiàn)灰白色半透明區(qū)，虹膜細(xì)節(jié)不清，瞳孔大小勉強看清3

角膜不透明，由于混濁，虹膜無法辨認(rèn)4眼刺激試驗--虹膜評分正常０皺褶明顯加深，充血，腫脹，角膜周圍輕度充血，瞳孔對光仍有反應(yīng)１出血，肉眼可見壞死，對光無反應(yīng)（或出現(xiàn)其中一種反應(yīng)）２第73頁/共166頁眼刺激試驗--結(jié)膜評分Ａ.充血（指瞼結(jié)膜、球結(jié)膜部位）血管正常０血管充血呈鮮紅色１血管充血呈深紅色，血管不易分辨彌漫性充血呈紫紅色３Ｂ.水腫無水腫０輕微水腫（包括瞬膜）１明顯水腫，伴有部分眼瞼外翻水腫至眼瞼近半閉合３水腫至眼瞼超半閉合４Ｃ.分泌物無分泌物０少量分泌物１分泌物使眼瞼和睫毛潮濕或粘著２分泌物使整個眼區(qū)潮濕或粘著３第74頁/共166頁眼刺激試驗--結(jié)膜評分眼刺激性評━━━━━━━━━━━━━━━━刺激程度積分━━━━━━━━━━━━━━━━無刺激性０～３輕度刺激性４～８中度刺激性９～１２強度刺激性１３～１６━━━━━━━━━━━━━━━第75頁/共166頁10.滴鼻劑和吸入劑急性毒性試驗?zāi)康模河^察一次滴入或吸入后所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)和死亡情況動物：大鼠、豚鼠或家兔。♀♂各半，大鼠、豚鼠體重在250-300g、家兔在2.5kg左右受試物：液體或粉末劑劑量：３個劑量，組距0.65-0.85為宜。設(shè)賦形劑或空白對照組。若大劑量組（超過臨床預(yù)計用量的50倍以上）未出現(xiàn)死亡情況時，則只須設(shè)一個高劑量組方法：大鼠或豚鼠每組10只，家兔每組４只，♀♂各半。滴入或吸入藥后，至少接觸４小時，給藥后即刻觀察及7-14天觀察動物全身狀況、體重、呼吸、循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動等變化，若出現(xiàn)死亡則病檢結(jié)果判斷：試驗結(jié)果與對照組比較。如能測出LD50值則按急性毒性試驗要求計算第76頁/共166頁11.直腸、陰道用藥急毒試驗?zāi)康模河^察直腸或陰道一次接觸受試物后，由吸敷所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)和死亡情況受試物：栓劑、液體或膏劑。劑量：３個，組距0.65-0.85，須設(shè)賦形劑或空白對照組方法：家兔每組４只，大鼠每組10只。將受試物置入≥４h。即刻觀察7-14天，觀察全身狀況，體重、呼吸、循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動等變化。若出現(xiàn)死亡時應(yīng)做病檢結(jié)果判斷：與對照組比較判斷。必要時算LD50目的：觀察直腸、陰道的刺激反應(yīng)動物：同上述急性毒性試驗受試物：栓劑、液體或膏劑分組：給藥組、賦形劑組和空白對照組。每組家兔４只，大鼠６只方法：受試物置入≥４h，24h后處死動物。取出局部直腸或陰道組織。觀察有無充血、紅腫等現(xiàn)象，若有變化需進行病檢第77頁/共166頁12.直腸、陰道用藥刺激試驗?zāi)康模河^察直腸、陰道的刺激反應(yīng)動物：同上述急性毒性試驗受試物：栓劑、液體或膏劑分組：給藥組、賦形劑組和空白對照組。每組家兔４只，大鼠６只方法：受試物置入≥４h，24h后處死動物。取出局部直腸或陰道組織。觀察有無充血、紅腫等現(xiàn)象，若有變化需進行病檢多次給受試物則一般每日一次，連續(xù)７天，于末次給藥后24h處死動物并觀察結(jié)果判斷：試驗結(jié)果與對照組比較判斷腔道用藥毒性試驗要特別注意既要符合劑型要求，又要考慮腔道可給容量第78頁/共166頁13.身體依賴性試驗-自然戒斷試驗------連續(xù)給藥后突然停藥，觀察戒斷癥狀，與同類的代表藥作對比，判斷受試藥的依賴性潛力-----動物：小、大鼠和猴。小鼠體重20-24g，每組≥20只，大鼠體重180-220g，每組≥10只,猴體重3-5kg，每組3～5只，♂♀各半------劑量：2～3，須設(shè)賦形劑對照和陽性藥對照(嗎啡，苯巴比妥或巴比妥)。低劑量用ACD；高劑量組依賴性潛力低的藥物應(yīng)選用接近毒性反應(yīng)的劑量，毒性低的藥物選用MTD。藥物可采用恒量或劑量遞增的方式給予-------連續(xù)給藥后突然停藥，觀察戒斷癥狀，與同類的代表藥作對比，判斷受試藥的依賴性潛力------動物：小、大鼠和猴。小鼠體重20-24g，每組≥20只，大鼠體重180-220g，每組≥10只,猴體重3-5kg，每組3～5只，♂♀各半------劑量：2～3，須設(shè)賦形劑對照和陽性藥對照(嗎啡，苯巴比妥或巴比妥)。低劑量用ACD；高劑量組依賴性潛力低的藥物應(yīng)選用接近毒性反應(yīng)的劑量，毒性低的藥物選用MTD。藥物可采用恒量或劑量遞增的方式給予第79頁/共166頁13.身體依賴性試驗-自然戒斷試驗------連續(xù)給藥后突然停藥，觀察戒斷癥狀，與同類的代表藥作對比，判斷受試藥的依賴性潛力-----動物：小、大鼠和猴。小鼠體重20-24g，每組≥20只，大鼠體重180-220g，每組≥10只,猴體重3-5kg，每組3～5只，♂♀各半------劑量：2～3，須設(shè)賦形劑對照和陽性藥對照(嗎啡，苯巴比妥或巴比妥)。低劑量用ACD；高劑量組依賴性潛力低的藥物應(yīng)選用接近毒性反應(yīng)的劑量，毒性低的藥物選用MTD。藥物可采用恒量或劑量遞增的方式給予------觀察指標(biāo)：鎮(zhèn)痛藥在停藥前24h及停藥后48h內(nèi)每隔4h觀察記錄外觀體征和行為活動、植物神經(jīng)系統(tǒng)機能變化，并稱重。鎮(zhèn)靜催眠藥在停藥前一天及停藥后的1至2周內(nèi)每天觀察動物的外觀體征和行為活動及自發(fā)驚厥發(fā)生率-------外觀體征和行為活動包括：應(yīng)激性、神情過敏(猴)、飲食、睡眠、自發(fā)運動活動、攻擊性、警覺程度、神經(jīng)反射、豎尾、震顫、驚厥、呼吸、體溫、體重------植物神經(jīng)系統(tǒng)機能變化：腹瀉、流涎、流淚、惡心、嘔吐、瞳孔大小------資料記錄及整理：①動物應(yīng)寫明種屬、性別、生產(chǎn)合格證號、記錄體重、實驗室溫度及濕度②受試物應(yīng)寫明生產(chǎn)批號、配制方法③戒斷癥狀用記分法統(tǒng)計，對檢測指標(biāo)和體重、驚厥發(fā)生率等應(yīng)設(shè)計合理的圖表顯示。實驗結(jié)果進行統(tǒng)計處理第80頁/共166頁14.身體依賴性試驗--替代試驗-----給予動物代表藥(如嗎啡、巴比妥或苯巴比妥)產(chǎn)生身體依賴性后，停止給藥，替之以受試藥，觀察記錄動物是否發(fā)生戒斷癥狀及發(fā)作程度----動物：參照“自然戒斷試驗”----劑量：參照“自然戒斷試驗”----給藥途徑：腹腔注射、灌胃或“藥摻食”(drugadmixedfood,DAF)法給予代表藥使產(chǎn)生身體依賴性，然后停止給代表藥，以同樣給藥方式給予不同劑量的受試藥,觀察及記錄替代期間動物的戒斷行為和體重變化-----鎮(zhèn)痛藥的觀察期為停止嗎啡前24h和停藥后48h內(nèi)，每4h觀察一次；鎮(zhèn)靜催眠藥的觀察為停止代表藥前一天和停藥后的1～2周內(nèi)，每天觀察一次-----采用1～2種給藥途徑，必須有一種與臨床用藥途徑相同-----觀察指標(biāo)：參照“自然戒斷試驗”-----資料記錄與整理：參照“自然戒斷試驗”第81頁/共166頁15.身體依賴性試驗--催促試驗---概念：短時期內(nèi)給予動物大劑量受試藥，然后注射受體對抗劑，觀察和記錄是否出現(xiàn)戒斷癥狀及其程度。此法只適用于有竟?fàn)幮允荏w對抗劑的阿片類藥物----動物：參照“自然戒斷試驗”----劑量：除低劑量組一般采用臨床劑量的1至2倍外，余同“自然戒斷試驗”---給藥途徑：猴的實驗應(yīng)采用與臨床給藥途徑相同；大、小鼠的實驗選用二種給藥途徑，其中必須有一種與臨床用藥途徑相同---給藥期限：猴連續(xù)給藥30～60天，上、下午各一次，大、小鼠連續(xù)給藥3～5天----停藥后給予阿片受體對抗劑，常用納洛酮，亦可用環(huán)丙羥丙嗎啡。觀察給受體對抗劑后1～2h內(nèi)動物出現(xiàn)的戒斷癥狀及體重變化---觀察指標(biāo)：參照“自然戒斷試驗”。小鼠適應(yīng)觀察記錄跳躍次數(shù)----資料記錄及整理：參照“自然戒斷試驗”第82頁/共166頁16.身體依賴性試驗--誘導(dǎo)試驗---概念：應(yīng)用各種誘發(fā)驚厥的方法如聽源性發(fā)作和戊四唑驚厥，對鎮(zhèn)靜催眠藥產(chǎn)生身體依賴性的動物，在斷藥期間閾下刺激強度就可出現(xiàn)反跳性興奮，誘發(fā)驚厥---動物：大、小鼠。應(yīng)預(yù)先挑選對各種閾下刺激無驚厥反應(yīng)鼠---劑量：參照“自然戒斷試驗”，陽性代表藥為苯巴比妥或巴比妥----給藥途徑：二種，有一種同臨床途徑----給藥期限：30天，每天二次，上、下午各一次----觀察指標(biāo)：聽源性發(fā)作實驗在停藥后的一周內(nèi)每天記錄發(fā)作率和體重；戊四唑?qū)嶒炘谕Ｋ?4h后記錄一次發(fā)作率和體重----資料記錄及整理：參照“自然戒斷試驗”第83頁/共166頁17.精神依賴性試驗---采用”自身給藥“測定iv藥物對動物的強化效應(yīng)---動物：200～250g的健康大鼠，♂♀各半----劑量：1～2個劑量組，加上一個陽性藥對照組(阿片類--鹽酸嗎啡，鎮(zhèn)靜催眠--苯巴比妥鈉或戊巴比妥鈉)，每組10只動物。---方法：戊巴比妥鈉麻醉下行頸外靜脈插管術(shù)，將插管一端固定于血管內(nèi)，另一端與恒速泵及藥液輸入系統(tǒng)相連。術(shù)后第二天開始對大鼠進行自身給藥訓(xùn)練，直至動物建立自身給藥(踏板)行為---觀察指標(biāo)：包括形成自身給藥行為的潛伏期、每個實驗期內(nèi)大鼠的自身給藥次數(shù)、行為變化、自身給藥行為隨藥物濃度變動的變化程度、消退反應(yīng)、與其它藥物的相互替代等----資料記錄及整理：參照“自然戒斷試驗”

第84頁/共166頁六、特殊毒性試驗1、目的意義2、定性差異3、定量差異4、致突變試驗5、生殖毒性(致畸)試驗6、致癌試驗第85頁/共166頁1、目的意義研究對遺傳物質(zhì)是否有損傷，是否會引起腫瘤、衰老及畸胎等特殊毒性試驗存在著種屬差異性定性差異定量差異第86頁/共166頁2、定性差異反應(yīng)停對家兔和７種靈長類動物致畸，但至少對10種品系大鼠、15種品系小鼠、2種家狗、３種田鼠和８種靈長類動物不致畸可的松對兔子和小鼠強力致畸，但對大鼠不致畸硫唑嘌呤對大鼠不致畸，但對兔子強致畸氨磺丁脲引起大鼠、小鼠眼畸形，但對兔子卻引起臉和內(nèi)臟畸形

第87頁/共166頁3、定量差異致畸劑量在人與動物、動物與動物間差異明顯

表人類與動物致畸劑量比較藥物最低致畸劑量（/kg/d)人與動物比值人動物反應(yīng)停0.5-1.0mg兔2.5mg

5-2.5

氨基喋呤50μg大鼠100μg2

氨甲喋呤42μg大鼠200μg4.8

乙烯雌酚20-80μg恒河猴200μg10-2.5

苯妥英鈉2mg小鼠50mg25第88頁/共166頁4、致突變試驗微生物回復(fù)試驗(Ames試驗）+哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞基因突變試驗+果蠅伴性隱性致死試驗染色體畸變試驗+嚙齒動物顯性致死試驗+精原細(xì)胞染色體畸變試驗動物微核試驗

+程序外DNA合成(UDS)試驗+SOS顯色試驗第89頁/共166頁微生物回復(fù)試驗菌株:組胺酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium),采用TA98、100、97、102,檢定符合要求,-80℃或液氮凍存?zhèn)溆脛┝浚河伤幬飳?xì)菌的毒性和溶解度決定

最高劑量：

a.一般5mg／皿

b.最高溶解度

c.根據(jù)殺菌情況確定最大濃度最低劑量：一般1μg／皿或0.1μg／皿。劑量級：5個以上第90頁/共166頁微生物回復(fù)試驗代謝活化：加肝臟微粒體酶(S9)和不加S9平行條件下測試對照：陰性、陽性對照和S9對照方法：標(biāo)準(zhǔn)平板法或預(yù)培養(yǎng)法，48h觀察結(jié)果，如菌落太小，可繼續(xù)培養(yǎng)并延長到72h觀察結(jié)果。每一濃度至少三皿，實驗至少重復(fù)一次結(jié)果判定：①受試物所誘發(fā)的回變菌落數(shù)(ｘ±ｓ)增加，超過對照2倍，量--效關(guān)系；②某測試點超過對照2倍以上，呈現(xiàn)可重復(fù)的并有統(tǒng)計學(xué)意義的增加。符合上述任何一條即可判為陽性第91頁/共166頁微生物回復(fù)試驗如某些藥物有明顯殺菌作用，可改用哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗如某些陽性或可疑陽性時，可選擇哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞基因突變試驗或果蠅伴性隱性致死試驗第92頁/共166頁哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞染色體畸變試驗細(xì)胞:建議首選中國倉鼠肺細(xì)胞(CHL),需定期檢查核型和有無支原體等污染。-80℃或液氮凍存劑量：高劑量以50％細(xì)胞生長抑制濃度為基準(zhǔn)，最高不要超過10mM分子量。溶解受限時可采用飽和濃度。中低劑量用倍量稀釋法。至少３個劑量代謝活化：應(yīng)用誘導(dǎo)劑處理后的哺乳動物肝微粒體酶（S9）進行體外代謝活化試驗第93頁/共166頁哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞染色體畸變試驗藥物作用時間:藥物和細(xì)胞接觸非活化組作用24h和48h收獲細(xì)胞,代謝活化組作用6小時以上標(biāo)本制作時間：藥物和細(xì)胞接觸后起算，分別在24h和48h收獲細(xì)胞對照：空白、溶劑、陽性和Ｓ９對照鏡檢：每種濃度至少觀察100個中期分裂相，在油鏡下分別記錄染色體的結(jié)構(gòu)畸變，多倍體以及畸變細(xì)胞數(shù)和畸變類型第94頁/共166頁哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞染色體畸變試驗受試物所誘發(fā)的染色體畸變數(shù)的增加與劑量相關(guān);CHL系統(tǒng)判定如下:畸變率<5%陰性(-)畸變率>5%可疑(±)畸變率>10%陽性(+)畸變率>20%陽性(++)畸變率>50%陽性(+++)注意：遇陽性或可疑陽性時，可選嚙齒動物顯性致死試驗或精原細(xì)胞染色體畸變試驗第95頁/共166頁嚙齒動物微核試驗動物：首選ＮＩＨ小鼠，每組１０只性成熟小鼠，雌雄各半，或至少６只性成熟雄性小鼠給藥途徑與方法：盡可能和臨床擬用途徑相同，一般為單次給藥或誘導(dǎo)給藥，必要時可多次給藥骨髓采樣時間：通過預(yù)試，在12-72h不同時間內(nèi)，取5個作用點，找出合適采樣時間，如無差別一般采用24h采樣劑量：≥3個，最高劑量1/2LD50對照組：用溶媒作陰性對照，用已知能誘發(fā)微核增加的物質(zhì)作陽性對照第96頁/共166頁嚙齒動物微核試驗標(biāo)本制作：取骨髓、涂片、Giemsa或丫啶橙熒光染色鏡檢：每只動物至少計數(shù)1000個多染紅細(xì)胞，Giemsa染色，觀察其微核出現(xiàn)的頻度及多染紅細(xì)胞和正常紅細(xì)胞的比率。丫啶橙熒光染色，則直接觀察微核出現(xiàn)的頻度判定：1.受試物所誘發(fā)的微核率的增加與劑量相關(guān)2.某一測試點微核增加可重復(fù)并有統(tǒng)計學(xué)意義符合上述一條即可判為陽性

第97頁/共166頁嚙齒動物微核試驗注意：1.對Giemsa染色中獲得可疑陽性或弱陽性結(jié)果的藥物