生鮮乳中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的測定液相色譜-柱后光化學(xué)衍生法警示：整個(gè)分析操作過程應(yīng)在指定區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。該區(qū)域應(yīng)避光（陽光），具備相對獨(dú)立的操作臺和廢棄物存放裝置。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，操作者應(yīng)按照接觸劇毒物的要求采取相應(yīng)的保護(hù)措施。范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定生鮮乳中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2含量的液相色譜-柱后光化學(xué)衍生測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于生鮮乳中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的定量測定。本標(biāo)準(zhǔn)方法的檢出限：黃曲霉毒素B1為0.002μg/kg，黃曲霉毒素B2為0.002μg/kg，黃曲霉毒素G2為0.002μg/kg，黃曲霉毒素G1為0.002μg/kg，黃曲霉毒素M1為0.005μg/kg，黃曲霉毒素M2為0.002μg/kg；本標(biāo)準(zhǔn)方法的定量限：黃曲霉毒素B1為0.006μg/kg，黃曲霉毒素B2為0.005μg/kg，黃曲霉毒素G2為0.005μg/kg，黃曲霉毒素G1為0.006μg/kg，黃曲霉毒素M1為0.015μg/kg，黃曲霉毒素M2為0.006μg/kg。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法原理試樣中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2用甲醇溶液提取，提取液經(jīng)黃曲霉素毒素免疫親和柱凈化、富集，用高效液相色譜分離后經(jīng)柱后光化學(xué)衍生，熒光檢測器檢測，外標(biāo)法定量。試劑和材料除非另有說明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑，水為GB/T6682中規(guī)定的一級水。甲醇：色譜純。乙腈：色譜純。甲醇水溶液：取50mL甲醇，加入50mL純水，混合均勻。流動(dòng)相：乙腈+水=20+80。分別取200mL乙腈，800mL水，混合均勻，并脫氣備用。黃曲霉毒素（B1、B2、G1、G2、M1、M2）標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：采購市售標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用甲醇配成100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。儲備液于-4℃避光保存（有效期三個(gè)月）。免疫親和柱：柱容量≥100ng（柱容量、回收率、柱回收率驗(yàn)證方法參見商品說明書）。對于每個(gè)批次的親和柱在使用前需進(jìn)行質(zhì)量驗(yàn)證。濾膜：0.45μm有機(jī)濾膜。儀器設(shè)備液相色譜儀：熒光檢測器。光化學(xué)衍生裝置。分析天平，感量0.01g。固相萃取裝置。旋渦混合器。冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不小于10000r/min。氮吹儀。測定步驟提取稱取20g樣品，精確到0.01g，置于50mL的離心管中，加入10mL甲醇，渦旋5min，以10000r/min的轉(zhuǎn)速在-5℃條件下于冷凍離心機(jī)離心10min，取上清液加水定容至50mL，備用。凈化將低溫下保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫，待免疫親和柱內(nèi)的液體放棄后，將上述樣液移至50mL注射器筒中，控制流速為1mL/min～3mL/min。待樣液滴完后，往注射器筒內(nèi)加入10mL水，以穩(wěn)定流速淋洗免疫親和柱后，吹干親和柱。加入2×2mL乙腈（或甲醇）洗脫親和柱，控制流速為1mL/min～3mL/min，吹干親和柱，收集全部洗脫液至刻度試管中。在50℃下氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两?，用初始流?dòng)相定容至1.0mL，渦旋30s溶解殘留物，0.45μm有機(jī)濾膜過濾，供液相色譜測定。標(biāo)準(zhǔn)曲線配置用流動(dòng)相（4.4）將黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2稀釋成0.1ng/mL～10.0ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。測定液相色譜參考條件液相色譜參考條件列出如下：色譜柱：C18柱（柱長250mm，柱內(nèi)徑4.6mm，填料粒徑5μm）；流動(dòng)相：乙腈+水（20+80，體積比）；柱溫：30℃；流速：0.8mL/min；進(jìn)樣量：20μL；檢測器：熒光檢測器；檢測波長：EX（激發(fā)波長）=355nm，EM（發(fā)射波長）=430nm。定量測定根據(jù)試樣溶液中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的含量情況，選定濃度相近的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的響應(yīng)值應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。對混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和試樣溶液等體積注入液相色譜儀。按照保留時(shí)間進(jìn)行定性，以標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量測定。標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖參見附錄A中圖A.1?？瞻自囼?yàn)除不稱取試樣外，均按上述步驟同時(shí)完成空白試驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理試樣中黃曲霉毒素以B1、B2、G1、G2、M1、M2分別計(jì)，單位為微克每千克（μg/kg），按下列公式（1）計(jì)算： （SEQ標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)公式\*ARABIC1）式中：——試樣中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；——從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上得到的被測組分溶液濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V——樣品溶液定容體積，單位為毫升（mL）；m——樣品溶液所代表試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測XX果用平行測定的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。重復(fù)性在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測XX果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%。

（資料性附錄）

黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2液相色譜圖說明：黃曲霉毒素B1、B2、G