微生物工程第十二章發(fā)酵的中間控制第一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二概述發(fā)酵過程工藝控制的目的、研究的方法和層次一發(fā)酵過程的種類分批培養(yǎng)補料分批培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)第二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二1、分批發(fā)酵簡單的過程，培養(yǎng)基中接入菌種以后，沒有物料的加入和取出，除了空氣的通入和排氣。整個過程中菌的濃度、營養(yǎng)成分的濃度和產(chǎn)物濃度等參數(shù)都隨時間變化。第三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二分批培養(yǎng)中微生物的生長遲滯期對數(shù)生長期穩(wěn)定期死亡期第四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二微生物生長分為：遲滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和死亡期在遲滯期，菌體沒有分裂只有生長，因為當(dāng)菌種接種入一個新的環(huán)境，細(xì)胞內(nèi)的核酸、酶等稀釋，這時細(xì)胞不能分裂。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的與細(xì)胞分裂相關(guān)的物質(zhì)濃度達到一定程度，細(xì)胞開始分裂，這時細(xì)胞生長很快，比生長速率幾近常數(shù)。這個時期稱為對數(shù)生長期第五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二隨著細(xì)胞生長，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物減少，廢物積累，導(dǎo)致細(xì)胞生長速率下降，進入減速期和穩(wěn)定期。最后當(dāng)細(xì)胞死亡速率大于生成速率，進入死亡期對于初級代謝產(chǎn)物，在對數(shù)生長期初期就開始合成并積累，而次級代謝產(chǎn)物則在對數(shù)生長期后期和穩(wěn)定期大量合成。第六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點優(yōu)點操作簡單，周期短，染菌機會少，生產(chǎn)過程和產(chǎn)品質(zhì)量容易掌握缺點產(chǎn)率低，不適于測定動力學(xué)數(shù)據(jù)第七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二2、補料分批培養(yǎng)

在分批培養(yǎng)過程中補入新鮮的料液，以克服營養(yǎng)不足而導(dǎo)致的發(fā)酵過早結(jié)束的缺點。在此過程中只有料液的加入沒有料液的取出，所以發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液體積比發(fā)酵開始時有所增加。在工廠的實際生產(chǎn)中采用這種方法很多。第八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二補料分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點優(yōu)點在這樣一種系統(tǒng)中可以維持低的基質(zhì)濃度，避免快速利用碳源的阻遏效應(yīng)；可以通過補料控制達到最佳的生長和產(chǎn)物合成條件；還可以利用計算機控制合理的補料速率，穩(wěn)定最佳生產(chǎn)工藝。缺點由于沒有物料取出，產(chǎn)物的積累最終導(dǎo)致比生產(chǎn)速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌機會第九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二3、半連續(xù)培養(yǎng)在補料分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上間歇放掉部分發(fā)酵液（帶放）稱為半連續(xù)培養(yǎng)。某些品種采取這種方式，如四環(huán)素發(fā)酵優(yōu)點放掉部分發(fā)酵液，再補入部分料液，使代謝有害物得以稀釋有利于產(chǎn)物合成，提高了總產(chǎn)量。缺點代謝產(chǎn)生的前體物被稀釋，提取的總體積增大第十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二4、連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵過程中一邊補入新鮮料液一邊放出等量的發(fā)酵液，使發(fā)酵罐內(nèi)的體積維持恒定。達到穩(wěn)態(tài)后，整個過程中菌的濃度，產(chǎn)物濃度，限制性基質(zhì)濃度都是恒定的。第十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點優(yōu)點控制稀釋速率可以使發(fā)酵過程最優(yōu)化。發(fā)酵周期長，得到高的產(chǎn)量。由于μ＝D，通過改變稀釋速率可以比較容易的研究菌生長的動力學(xué)缺點菌種不穩(wěn)定的話，長期連續(xù)培養(yǎng)會引起菌種退化，降低產(chǎn)量。長時間補料染菌機會大大增加。第十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二二發(fā)酵過程工藝控制的目的有一個好的菌種以后要有一個配合菌種生長的最佳條件，使菌種的潛能發(fā)揮出來目標(biāo)是得到最大的比生產(chǎn)速率和最大的生產(chǎn)率第十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二發(fā)揮菌種的最大生產(chǎn)潛力考慮之點菌種本身的代謝特點生長速率、呼吸強度、營養(yǎng)要求（酶系統(tǒng)）、代謝速率菌代謝與環(huán)境的相關(guān)性溫度、pH、滲透壓、離子強度、溶氧濃度、剪切力等第十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二微生物代謝是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，它的代謝呈網(wǎng)絡(luò)形式，比如糖代謝產(chǎn)生的中間物可能用作合成菌體的前體，可能用作合成產(chǎn)物的前體，也可能合成副產(chǎn)物，而這些前體有可能流向不同的反應(yīng)方向，環(huán)境條件的差異會引發(fā)代謝朝不同的方向進行。第十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二微生物的生長與產(chǎn)物合成有密切相關(guān)性，不僅表現(xiàn)在菌體量的大小影響產(chǎn)物量的多少，而且菌體生長正常與否，即前期的代謝直接影響中后期代謝的正常與否。特別是對于次級代謝產(chǎn)物的合成更具有復(fù)雜性因此對發(fā)酵過程的了解不能機械的，割裂的去認(rèn)識，而要從細(xì)胞代謝水平和反應(yīng)工程水平全面的認(rèn)識第十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二發(fā)酵過程受到多因素又相互交叉的影響如菌本身的遺傳特性、物質(zhì)運輸、能量平衡、工程因素、環(huán)境因素等等。因此發(fā)酵過程的控制具有不確定性和復(fù)雜性。為了全面的認(rèn)識發(fā)酵過程，本章首先要告訴大家分析發(fā)酵過程的基本方面，在此基礎(chǔ)上再舉一些例子，說明如何綜合分析發(fā)酵過程及進行優(yōu)化放大。第十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二三發(fā)酵過程研究的方法和層次1、研究方法單因子實驗：對實驗中要考察的因子逐個進行試驗，尋找每個因子的最佳條件。一般用搖瓶做實驗優(yōu)點一次可以進行多種條件的實驗，可以在較快時間內(nèi)得到的結(jié)果。缺點如果考察的條件多，實驗時間會比較長各因子之間可能會產(chǎn)生交互作用，影響的結(jié)果準(zhǔn)確性第十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二數(shù)理統(tǒng)計學(xué)方法：運用統(tǒng)計學(xué)方法設(shè)計實驗和分析實驗結(jié)果，得到最佳的實驗條件。如正交設(shè)計、均勻設(shè)計、響應(yīng)面設(shè)計。優(yōu)點同時進行多因子試驗。用少量的實驗，經(jīng)過數(shù)理分析得到單因子實驗同樣的結(jié)果，甚至更準(zhǔn)確，大大提高了實驗效率。但對于生物學(xué)實驗要求準(zhǔn)確性高，因為實驗的最佳條件是經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)方法算出來的，如果實驗中存在較大的誤差就會得出錯誤的結(jié)果。第十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二2、研究的層次初級層次的研究：一般在搖瓶規(guī)模進行試驗。主要考察目的菌株生長和代謝的一般條件，如培養(yǎng)基的組成、最適溫度、最適pH等要求。搖瓶研究的優(yōu)點是工作量大，可以一次試驗幾十種甚至幾百種條件，對于菌種培養(yǎng)條件的優(yōu)化有較高的效率。第二十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二代謝及工程參數(shù)層次研究：一般在小型反應(yīng)器規(guī)模進行試驗。在搖瓶試驗的基礎(chǔ)上，考察溶氧、攪拌等搖瓶上無法考察的參數(shù)，以及在反應(yīng)器中微生物對各種營養(yǎng)成分的利用速率、生長速率、產(chǎn)物合成速率及其它一些發(fā)酵過程參數(shù)的變化，找出過程控制的最佳條件和方式。由于罐發(fā)酵中全程參數(shù)的是連續(xù)的，所以得到的代謝情況比較可信。第二十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二國家生物工程中心創(chuàng)制的全參數(shù)發(fā)酵罐除了裝備有常規(guī)發(fā)酵罐的溫度、溶氧、pH電極，得到發(fā)酵全過程的這些參數(shù)外，還有罐體稱重，補料計量裝置和尾氣采集分析系統(tǒng)，更重要的是，有一套獨特的數(shù)據(jù)處理軟件，軟件的開發(fā)是長期科研成果的結(jié)晶，可以得到14個發(fā)酵過程參數(shù)，并且可以輸入和繪制人工測定的參數(shù)，對發(fā)酵過程的分析起到了重要的作用第二十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二第二十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二鳥苷發(fā)酵過程曲線第二十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二生產(chǎn)規(guī)模放大：在大型發(fā)酵罐規(guī)模進行試驗。將小型發(fā)酵罐的優(yōu)化條件在大型反應(yīng)器上得以實現(xiàn),達到產(chǎn)業(yè)化的實現(xiàn)。一般來說微生物在不同體積的反應(yīng)器中的生長速率是不同的，原因可能是，罐的深度造成氧的溶解度、空氣停留時間和分布不同，剪切力不同，滅菌時營養(yǎng)成分破壞程度不同所致。第二十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二四、發(fā)酵過程的中間分析發(fā)酵過程的中間分析是生產(chǎn)控制的眼睛，它顯示了發(fā)酵過程中微生物的主要代謝變化。因為微生物個體極微小，肉眼無法看見，要了解它的代謝狀況，只能從分析一些參數(shù)來判斷，所以說中間分析是生產(chǎn)控制的眼睛。這些代謝參數(shù)又稱為狀態(tài)參數(shù)，因為它們反映發(fā)酵過程中菌的生理代謝狀況，如pH，溶氧，尾氣氧，尾氣二氧化碳，粘度，菌濃度等第二十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二代謝參數(shù)按性質(zhì)分可分三類：物理參數(shù)：溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、空氣壓力、空氣流量、溶解氧、表觀粘度、排氣氧（二氧化碳）濃度等化學(xué)參數(shù)：基質(zhì)濃度（包括糖、氮、磷）、pH、產(chǎn)物濃度、、核酸量等生物參數(shù)：菌絲形態(tài)、菌濃度、菌體比生長速率、呼吸強度、基質(zhì)消耗速率、關(guān)鍵酶活力等第二十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二從檢測手段分可分為：直接參數(shù)、間接參數(shù)直接參數(shù)：通過儀器或其它分析手段可以測得的參數(shù)，如溫度、pH、殘?zhí)堑乳g接參數(shù)：將直接參數(shù)經(jīng)過計算得到的參數(shù)，如攝氧率、KLa等第二十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二直接參數(shù)又可分為在線檢測參數(shù)和離線檢測參數(shù)在線檢測參數(shù)指不經(jīng)取樣直接從發(fā)酵罐上安裝的儀表上得到的參數(shù)，如溫度、pH、攪拌轉(zhuǎn)速；離線檢測參數(shù)指取出樣后測定得到的參數(shù)，如殘?zhí)?、NH2-N、菌體濃度。第二十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二（一）發(fā)酵過程主要分析的項目目前發(fā)酵過程主要分析項目如下1、pHpH與微生物的生命活動密切相關(guān)——酶催化活性pH的變化又是微生物代謝狀況的綜合反映——基質(zhì)代謝、產(chǎn)物合成、細(xì)胞狀態(tài)、營養(yǎng)狀況、供氧狀況第三十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二2、排氣氧、排氣CO2和呼吸熵排氣氧的濃度表征了進氣的氧被微生物利用以后還剩余的氧，因此排氣氧的大小反映了菌生長的活性，通過計算可以求得攝氧率（OUR）。排氣二氧化碳反映了微生物代謝的情況，因為微生物攝入的氧并不是全部變成二氧化碳的，有的進入代謝中間物分子，進入細(xì)胞或產(chǎn)物，因此消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有機物降解后會產(chǎn)生二氧化碳，使排氣二氧化碳大于消耗的氧。第三十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二RQ值隨微生物菌種的不同，培養(yǎng)基成分的不同，生長階段的不同而不同。測定RQ值一方面可以了解微生物代謝的狀況，另一方面也可以指導(dǎo)補料CER表示單位體積發(fā)酵液單位時間內(nèi)釋放的二氧化碳的量呼吸熵＝呼吸熵反映了氧的利用狀況第三十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二

一般在發(fā)酵中后期為保證產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，有意使菌體處于半饑餓狀態(tài)，在營養(yǎng)限制的條件下，維持產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的速率在較高水平。對于這種工藝，后期的補料控制是關(guān)鍵。過程中發(fā)現(xiàn)，在補糖開始時，不但CER、OUR大幅度提高，連RQ也提高約10％，表明通過補糖不但提供了更多的碳源，而且隨著體系內(nèi)葡萄糖濃度提高，糖代謝相關(guān)酶活力也提高，產(chǎn)能增加。第三十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二3、糖含量微生物生長和產(chǎn)物合成與糖代謝有密切關(guān)系。糖的消耗反映產(chǎn)生菌的生長繁殖情況反映產(chǎn)物合成的活力菌體生長旺盛糖耗一定快，殘?zhí)且簿徒档偷每焱ㄟ^糖含量的測定，可以控制菌體生長速率，可控制補糖來調(diào)節(jié)pH，促進產(chǎn)物合成，不致于盲目補糖，造成發(fā)酵不正常。糖含量測定包括總糖和還原糖。

總糖指發(fā)酵液中殘留的各種糖的總量。如發(fā)酵中的淀粉、飴糖、單糖等各種糖。

還原糖指含有自由醛基的單糖，通常指的是葡萄糖。第三十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二4、氨基氮和氨氮氨基氮指有機氮中的氮（NH2-N），單位是mg/100ml。如氨基酸中的氮，黃豆餅粉、花生餅粉中都有有機氮。氨氮指無機氨中的氮（NH3-N）。氮利用快慢可分析出菌體生長情況，含氮產(chǎn)物合成情況。但是氮源太多會促使菌體大量生長。有些產(chǎn)物合成受到過量銨離子的抑制，因此必須控制適量的氮。通過氨基氮和氨氮的分析可控制發(fā)酵過程，適時采取補氨措施。發(fā)酵后期氨基氮回升，這時就要放罐，否則影響提取過程。第三十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二5、磷含量微生物體內(nèi)磷含量較高，培養(yǎng)基中以磷酸鹽為主，發(fā)酵中用來計算磷含量的是磷酸根。磷是核酸的組成部分，是高能化合物ATP的組成部分，磷還能促進糖代謝。因此磷在培養(yǎng)基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取補磷措施。第三十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二6、菌濃度和菌形態(tài)菌形態(tài)和菌濃度直接反映菌生長的情況。菌形態(tài)顯微鏡觀察菌濃度的測定是衡量產(chǎn)生菌在整個培養(yǎng)過程中菌體量的變化，一般前期菌濃增長很快，中期菌濃基本恒定。補料會引起菌濃的波動，這也是衡量補料量適合與否的一個參數(shù)。第三十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二第三十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二第三十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二菌濃測定方法測粘度壓縮體積法（離心）靜置沉降體積法光密度測定法OD600~660適合于細(xì)菌、酵母第四十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二7、產(chǎn)物濃度

在培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生菌的合成能力和產(chǎn)物積累情況都要通過產(chǎn)物量的測定來了解，產(chǎn)物濃度直接反映了生產(chǎn)的狀況,是發(fā)酵控制的重要參數(shù)。而且通過計算還可以得到生產(chǎn)速率和比生產(chǎn)速率，從而分析發(fā)酵條件如補料、pH對產(chǎn)物形成的影響。第四十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二(二)產(chǎn)物量的測定1、產(chǎn)物量的特殊表示法（1）、抗生素效價的表示抗生素效價表示抗生素的有效成分的多少，效價大小用單位（U）來表示效價表示方法：重量折算法重量單位類似重量單位特殊單位第四十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二重量折算單位：以最低抑菌濃度為一個單位，如青霉素0.6微克＝1U重量單位：規(guī)定某些抗生素活性部分1μg=1u如鏈霉素、卡那霉素、紅霉素等定義活性部分1μg＝1u第四十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二類似重量單位：規(guī)定抗生素的某種鹽1mg=1000u如金霉素、四環(huán)素的鹽酸鹽定一為1μg＝1u特殊單位：藥檢所制定某些抗生素的單位制霉菌素1mg=3700u多粘菌素B1mg=10000u第四十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二2、酶活力的表示法酶活力用單位來表示。由于酶通常不是很純，不能用重量來表示酶的量。同一種酶用不同的方法測定會有不同的酶活單位，容易造成混亂，為此國際上作了統(tǒng)一規(guī)定，規(guī)定在250C下，以最適的底物濃度，最適的緩沖液離子強度，以及最適的pH諸條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一微克分子底物的酶定量為一個活性單位。第四十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二2、產(chǎn)物量的測定（1）、化學(xué)法①滴定法產(chǎn)物能使一定指示劑變色來指示反應(yīng)終點的可用滴定法如青霉素在堿性條件下加入過量的I2，反應(yīng)生成青霉噻唑酸碘，用Na2S2O3滴定多余的碘，可計算出青霉素的單位檸檬酸可以用NaOH滴定來計算檸檬酸產(chǎn)量第四十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二②比色法產(chǎn)物經(jīng)一定化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生顏色，且顏色深淺與產(chǎn)物濃度成正比，可以用比色法測定。淀粉酶活力測定：在1%可溶性淀粉溶液中加入淀粉酶，所釋放出的麥芽糖與生色試劑（3，5-二硝基水楊酸與酒石酸鉀鈉的堿溶液）產(chǎn)生顏色，它在540nm處所得吸光度跟淀粉酶活力成正比。第四十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二③測壓法產(chǎn)物特定反應(yīng)放出或攝入氣體，使系統(tǒng)有壓力變化，可以通過測定壓力變化得知產(chǎn)物量。（2）、物理法許多酶、抗生素都有不對稱碳原子，具有旋光性，因此可以通過測定旋光度來測定酶或抗生素的含量。谷氨酸γ－氨基丁酸＋CO2第四十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二化學(xué)和物理方法優(yōu)點：快速、方便，經(jīng)常用于過程分析缺點產(chǎn)品中存在的雜質(zhì)會干擾測定結(jié)果，因此抗生素成品的測定用生物法測定。

適用于抗生素效價的測定

生物法以抗生素的殺菌能力為衡量效價的標(biāo)準(zhǔn)，其原理恰好與臨床應(yīng)用的要求相一致，而且此法靈敏度高，需用的檢品量較小，這是其它方法不能比的。但此法得到結(jié)果比較慢，需經(jīng)過16~18小時培養(yǎng)。生物法常用于發(fā)酵終了產(chǎn)品效價的測定。（3）、生物法第四十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二常用的生物法測定抗生素，采用杯碟法“杯”是放被測抗生素的不銹鋼小管，小管內(nèi)徑為6mm，高10mm的圓筒形管子，管子的重量盡可能相等。碟是攤布培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)皿。操作方法是：將已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基加熱到完全融化，倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，每碟15ml（下層），待其凝固。此外，將融化的培養(yǎng)基冷卻到500C左右混入試驗菌，將混有菌的培養(yǎng)基5ml加到已凝固的培養(yǎng)基上待凝固（上層）。

第五十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二在培養(yǎng)基表面垂直放上小杯，在杯中加入待檢樣品，加滿后在370C培養(yǎng)16~18小時。在培養(yǎng)中,一方面試驗菌開始生長另一方面抗生素呈球面擴散，離杯越近，抗生素濃度越大，離杯越遠(yuǎn)抗生素濃度越小。隨著抗生素濃度減小，有一條最低抑菌濃度帶，在帶范圍內(nèi)，菌不能生長，而呈透明的圓圈，這就叫“抑菌圈”?？股貪舛仍礁?，抑菌圈越大，第五十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二r:抑菌圈的半徑(毫米）M：抗生素在管中的量（單位）C：最低抑菌濃度（單位/毫升）H：培養(yǎng)基的厚度（毫米）L：管子的高度（毫米）D：抗生素的擴散系數(shù)（毫米/小時）T：細(xì)菌生長到肉眼所用的時間（小時）第五十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二抗生素濃度與抑菌圈的半徑成一定數(shù)學(xué)關(guān)系logM=(1/9.21DT)r2+log(C.4πDTH)抗生素的總量的對數(shù)值與抑菌圈半徑的平方呈正比。此外還受C、H、D、T的影響但是C、H、D、T是無法測量的，在實際計算中要設(shè)法消去第五十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二一般的消去方法有二劑量法標(biāo)準(zhǔn)曲線法第五十四頁，共六十三頁，編輯于2