HSP90β基因突變與糖皮質(zhì)激素治療敏感性的關(guān)系【摘要】目的：篩選腎病綜合征患者熱休克蛋白90β基因突變,并分析該突變與糖皮質(zhì)激素治療敏感性的關(guān)系.方法：提取300例經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療的腎病綜合征患者血液DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction)和自動熒光測序方法,對HSP90基因intron9，exon10，intron10，exon11，3非編碼區(qū)域DNA序列進(jìn)行突變分析，結(jié)合臨床資料探討突變與糖皮質(zhì)激素治療敏感性的關(guān)系.結(jié)果：在腎病綜合征患者中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)HSP90β基因點(diǎn)突變，分別為intron10的7489CT和3非編碼區(qū)的7612CT,其發(fā)生頻率在糖皮質(zhì)激素敏感和不敏感患者中分別為和,兩組患者的突變頻率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異().結(jié)論：在腎病綜合征患者中發(fā)現(xiàn)9例7489CT和8例7612CT突變，在敏感和不敏感組的發(fā)生頻率無顯著差異，提示HSP90β表達(dá)量與GC治療敏感性無顯著相關(guān).

【關(guān)鍵詞】熱休克蛋白90β；糖皮質(zhì)激素類；突變

0引言

熱休克蛋白90是體內(nèi)普遍存在、高度保守的一類分子伴侶蛋白，是熱休克蛋白家族中的重要成員之一，在正常細(xì)胞內(nèi)有較高的組成性表達(dá)，約占細(xì)胞內(nèi)蛋白含量的1%~2%［1］，它們參與眾多的細(xì)胞生理過程.有人［2］在高加索人中檢測到HSP90基因突變，但未作進(jìn)一步的分析.因此，HSP90在糖皮質(zhì)激素糖皮質(zhì)激素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用尤其引起我們的關(guān)注.但目前國內(nèi)尚無人HSP90基因變異以及與GCGR效應(yīng)或激素敏感性的相關(guān)研究，故本研究旨在篩查腎病綜合征患者的HSP90β是否存在突變，并分析該突變與糖皮質(zhì)激素治療敏感性的關(guān)系，進(jìn)一步探討HSP90β在糖皮質(zhì)激素治療敏感性差異中的作用，為臨床治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo).

1對象和方法

對象所收集病例來自第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院和大坪醫(yī)院，均符合1985年中華全國第二次腎病學(xué)術(shù)會議制訂的腎病綜合癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，治療方法采用激素治療標(biāo)準(zhǔn)方法.①敏感組：激素治療后8wk內(nèi)尿蛋白轉(zhuǎn)陰，水腫消退.164例患者，其中男79例，女85例，年齡17～66歲.②不敏感組:治療8wk內(nèi)水腫未消退，或尿蛋白仍“+”以上，136例患者，其中男71例,女65例,年齡22～63歲.用EDTANa2抗凝管抽取清晨空腹靜脈血2mL,置-20℃凍存待檢.DNA純化試劑盒購自Promega公司;Taq多聚酶購自寶生物公司.細(xì)胞裂解液Ⅰ：10mmol/L,10mmol/LKCl,10mmol/LMgCl.細(xì)胞裂解液Ⅱ：10mmol/L,10mmol/LKCl,10mmol/LMgCl2，mol/LNaCl,5g/LSDS，2mmol/LEDTANa2.NP40為Sigma公司產(chǎn)品，酚、氯仿、異戊醇、乙酸鈉購自重慶醫(yī)藥股份有限公司.全自動凝膠成像分析系統(tǒng),PTC100TMPCR儀(MJResearch,美國)，全自動基因測序分析儀CEQ8000.

方法

基因組DNA的提取全血DNA的提取采用NP40法.取500μL抗凝血于mL的Eppendorf管,分別加入細(xì)胞裂解液Ⅰ和NP40,細(xì)胞裂解液Ⅱ裂解后用依次用酚、氯仿抽提，乙酸鈉、異戊醇沉淀后可見白色絲狀沉淀,乙醇洗滌后溶于TEBuffer，-20℃保存.用瓊脂糖凝膠檢查DNA的完整性及濃度,調(diào)整DNA的濃度至(300~500)ng/μL.

引物序列與PCR反應(yīng)參照Genbank提供的HSP90βDNA序列和閱讀框設(shè)計(jì)引物,其序列為Sense:5′GCCAGCATGGTCTCAAACTC3′；Antisense:5′CATCCAATCCTGCTGTCAAG3′.擴(kuò)增產(chǎn)物為881bp，擴(kuò)增區(qū)域包括HSP90β基因intron9,exon10,intron10,exon11,3′非編碼區(qū)域.PCR反應(yīng)體系總體積為50μL.擴(kuò)增條件為94℃，5min,94℃變性30s,60℃退火30s，72℃延伸1min,35個(gè)循環(huán)后,72℃延伸10min.取10μL加有載樣緩沖液的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加樣至15g/L瓊脂糖凝膠中,在電壓100V下電泳30min后,于全自動凝膠成像分析系統(tǒng)記錄結(jié)果進(jìn)行分析.

產(chǎn)物的純化及序列測定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠純化回收按照Promega公司試劑盒操作說明進(jìn)行.純化回收后使用BECKMANCEQ8000全自動基因測序分析儀測定產(chǎn)物序列.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理糖皮質(zhì)激素治療敏感性與HSP90β的等位基因相關(guān)性通過優(yōu)勢比OR(OddsRate)按公式計(jì)算:OR=ad/bc.式中a為HSP90β基因有突變的糖皮質(zhì)激素不敏感的原發(fā)性腎病綜合征患者；b為HSP90β基因無突變的糖皮質(zhì)激素不敏感患者；c為HSP90β基因有突變的糖皮質(zhì)激素敏感的患者；d為HSP90β基因無突變的糖皮質(zhì)激素敏感的患者.OR的顯著性檢驗(yàn)按Yates校正公式計(jì)算:λ2=(ad-bc-n/2)2n/(a+b)(c+d)(a+c)(b+d).

2結(jié)果

擴(kuò)增目的片斷HSP90β基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜，得到的產(chǎn)物長度為881bp，條帶特異，符合預(yù)期設(shè)結(jié)果.

M：DL2000Maker，1~4：PCR產(chǎn)物.

圖1PCR擴(kuò)增HSP90β目的基因片段

序列測定在收集的腎病綜合征患者中共檢測到2個(gè)位點(diǎn)突變，分別是HSP90β基因intron10的7489CT和3‘非編碼區(qū)的7612CT，其中7489CT有9例，7612CT有8例.糖皮質(zhì)激素治療敏感和不敏感患者HSP90β基因頻率、RR值及顯著性分析顯示,在糖皮質(zhì)激素敏感患者和不敏感患者中該位點(diǎn)基因突變的頻率分別為,突變位點(diǎn)多態(tài)性分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異().HSP90β基因3‘非編碼區(qū)存在7612CT突變,在糖皮質(zhì)激素敏感患者和不敏感患者中該位點(diǎn)基因突變的頻率分別為,突變位點(diǎn)多態(tài)性分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(，表1).

表1HSP90β基因7489,7612位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率分析

3討論

自1962年Ritosa發(fā)現(xiàn)熱休克反應(yīng)后，熱休克蛋白的研究引起了人們廣泛的關(guān)注.HSP90β通過改變糖皮質(zhì)激素受體的立體結(jié)構(gòu)使之產(chǎn)生特定的生物學(xué)效應(yīng)［3-4］.而HSP90作為GCGR效應(yīng)通路中的重要分子伴侶，其結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化都將影響GCGR效應(yīng)的發(fā)揮.

以往多數(shù)研究者從GR的基因多態(tài)性方面進(jìn)行研究，并證明多種自身免疫性疾病GR自身結(jié)構(gòu)的變化對GCGR效應(yīng)有顯著的影響［5-6］，但是僅少數(shù)可檢測到GR基因變異.Koper等［7］在正常人群中也發(fā)現(xiàn)GR基因結(jié)構(gòu)異常的個(gè)體,他們臨床上均無明顯癥狀,因此這一說法尚不能完全解釋GCGR效應(yīng)差異的問題.Bohen等［8］在研究GR功能時(shí)發(fā)現(xiàn)釀酒酵母HSP82(與人HSP90相對應(yīng))突變體中GR的活性明顯下降.我室之前的研究發(fā)現(xiàn)同系不同株的小鼠BALB/C和C57BL/6的HSP84中存在4個(gè)有意義突變，并且兩種小鼠在應(yīng)激時(shí)的死亡率、GR的核轉(zhuǎn)位效應(yīng)都存在顯著差異.因此本實(shí)驗(yàn)收集了300例經(jīng)GC治療的腎病綜合征患者，檢測是否存在HSP90β基因變異，并進(jìn)一步分析HSP90β基因變異與激素治療敏感性的關(guān)系.通過對人HSP90β基因結(jié)構(gòu)和在小鼠中已發(fā)現(xiàn)的4個(gè)有意義突變位點(diǎn)的分析，本研究確定檢測的區(qū)域包括HSP90β的二聚化和GR結(jié)合域兩個(gè)重要功能域.HSP90基因GR結(jié)合域的基因變異可以影響GCGR復(fù)合物的形成，同時(shí)其二聚化位點(diǎn)的基因變異引起HSP90蛋白二聚體構(gòu)象發(fā)生變化，形成不穩(wěn)定且不利于GC結(jié)合的GR復(fù)合物，或者結(jié)合GC后不能充分暴露出核定位信號，減少GR的核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而減少受GR調(diào)控的脂皮素、IL1、NOS等炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，達(dá)到減輕炎癥的效果，從而影響GC治療敏感性.

在本實(shí)驗(yàn)研究的164例激素敏感患者和136例激素不敏感患者中，腎病綜合征患者HSP90β基因7489CT，7612CT基因突變在GC治療敏感和不敏感患者中的基因頻率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異()，提示在原發(fā)性腎病綜合征患者中GC治療敏感性與HSP90β基因7489,7612位點(diǎn)突變無關(guān).由于已發(fā)現(xiàn)的突變均位于非翻譯區(qū)，其變化只影響HSP90β的表達(dá)量，而表達(dá)量的變化對腎病綜合征GC治療敏感性無關(guān)，我們推測HSP90β是通過結(jié)構(gòu)的差異影響GCGR效應(yīng)，但差異來自HSP90β基因表達(dá)區(qū)的何處突變目前還缺少證據(jù)，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明.

【參考文獻(xiàn)】

［1］ChenB,ZhongDB,MonteiroA.ComparativegenomicsandevolutionoftheHSP90familyofgenesacrossallkingdomsoforganisms［J］.BMCGenomics,2006,7:156.

［2］PassarinoG,GianpieroLC,StecconiR,etal.MolecularVariationofHumanHSP90aandHSP90bGenesinCaucasians［J］.HumanMutation,2003,21(5):554-555.

［3］KanelakisKC,PrattWB.RegulationofglucocorticoidreceptorligandbindingactivitybytheHSP90/hsp70basedchaperonemachinery［J］.MethodsEnzymol,2003,364:159-173.

［4］PearlLH,ProdromouC.StructureandinvivofunctionofHsp90［J］.CurreOpinionStructBiol,2000,10:46-51.

［5］KoyanoS,SaitoY,NaganoM,etal.Functionalanalysisofthreegeneticpolymorphismsintheglucocorticoidreceptorgene［J］.JPharmacolExpTher,2003,307(1):110-116.

［6］LautenM,BegerC,GerdesK,etal.Expressionofheatshockprotein90inglucocorticoidsensitiveandresistantchildhoodacutelymphoblasticleukaemia［J］.Leukemia,2003,17(8):1551-1156.

［7］KoperJW,StolkRP,LangeR,etal.Lakeofassociationbetweenfivepolymorphismsin