動(dòng)物基因組的分離定量葉第一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日分離純化核酸總的原則：

①應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性②排除其它分子的污染。核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求：

①核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；②排除其它核酸分子的污染；③其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度。第二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)從動(dòng)物組織中制備染色體DNA的方法。學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)DNA的純度、DNA的構(gòu)型、含量以及分子量的大小。掌握DNA樣品的純化和定量檢測(cè)方法。第三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日組織裂解液裂解細(xì)胞:

SDS能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸。EDTA可抑制DNA酶的活性。NaCl;Tris·HCl;EDTA；SDS；蛋白酶K；無DNA酶的RNA酶實(shí)驗(yàn)原理第四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日用蛋白酶K水解蛋白質(zhì)蛋白酶K具有廣泛的切割活性，可消化細(xì)胞，降解蛋白質(zhì)。有機(jī)溶劑酚、氯仿抽提苯酚使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)抑制了DNase的降解作用。氯仿加速有機(jī)相與液相分層，最后用氯仿抽提可去除核酸溶液中的跡量酚。異戊醇減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡；有助于分相。第五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日在高鹽條件下，用乙醇沉淀DNADNA不溶于乙醇，乙醇可以沉淀DNA。NaAc：Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀;調(diào)節(jié)PH值接近DNA等電點(diǎn)；再用70%乙醇洗除沉淀中的鹽分即可獲得染色體DNA第六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日酚：氯仿：異戊醇（25：4：1）70%乙醇TEbufferRNAse瓊脂糖TAE電泳緩沖液電泳設(shè)備紫外分光光度計(jì)凝膠成像系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)材料第七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日溶液與緩沖液勻漿緩沖液STE：100mmol/LNaCl10mmol/LTris·HCl，pH8.025mmol/LEDTA，pH8.0。消化緩沖液：100mmol/LNaCl10mmol/LTris·HCl，pH8.025mmol/LEDTA，pH8.0第八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日0.5%SDS（臨用前加）。0.1mg/mL蛋白酶K（臨用前加）。無DNA酶的RNA酶(10mg/L)：將胰RNA酶溶于10mmol/LTris·HCl，pH7.5，15mmol/LNaCl溶液中，使?jié)舛葹?0mg/L，于100℃水浴處理15min，以降解DNA酶，緩慢冷卻到室溫，－20℃保存。TE緩沖液：10mmol/LTris·HCl，pH8.01mmol/LEDTA，pH8.0平衡酚:氯仿:異戊醇＝25:24:1（體積比）。3mol/LNaAc，pH5.2：稱取408gNaAc·3H2O溶于水，用3mol/L乙酸調(diào)節(jié)至pH5.2。無水乙醇。70％冷乙醇第九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日實(shí)驗(yàn)步驟：DNA提取1.材料準(zhǔn)備2.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放3.核酸分離、純化4.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)5.核酸溶解在適量緩沖液或水中第十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日1、先將動(dòng)物組織進(jìn)行預(yù)處理：大的器官應(yīng)該切成易處理的小塊（1cm3）以便凍存（用液氮）及處理。任何組織都可采用，但是，如需肝臟，在殺動(dòng)物之前應(yīng)該禁食24h，可提高DNA的質(zhì)量。收集的組織可以在－70℃下保存幾年。2、取0.2g組織塊剪碎后，加入2.0mL勻漿緩沖液，用組織勻漿器勻漿至無明顯組織塊存在（冰浴操作）。3、將組織細(xì)胞的勻漿液體轉(zhuǎn)移至2.0mL離心管中，\4、加入蛋白酶k，輕輕反轉(zhuǎn)混勻，37℃溫育12～18h。溫育結(jié)束前1h加RNAe至終濃度200g/mL第十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日5、加入等體積酚／氯仿／異戊醇（25：4：1）等體積抽提1~3次，緩慢顛倒離心管使兩相均勻混合形成乳濁液，靜置3min。12000rpm，離心5分鐘,擴(kuò)口吸頭小心吸出離心管中的上層液體，即為含DNA的水相，注意不要吸中間界面上一層厚的白色物質(zhì)（蛋白質(zhì)沉淀）。6．加入1/10倍體積3MNaAc（pH5.2），2倍體積無水乙醇充分混勻，-20℃下15-20min。7．4℃15000rpm，離心min。8．DNA沉淀用冰預(yù)冷70%乙醇洗1次，開蓋37℃干燥10min（使乙醇揮發(fā)）。9．根據(jù)沉淀量加入TEbuffer，37℃水浴至沉淀溶解，－20℃冰箱保存。。第十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日如果要對(duì)提取的DNA進(jìn)行完整性鑒定，可通過瓊脂糖凝膠。方法是取1l溶解的DNA樣品，在0.8％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，用dured染色觀察結(jié)果。10．取1μlDNA0.8%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄和分析結(jié)果，估計(jì)樣品DNA分子量。11．取10μlDNA母液稀釋至1000ul，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)A260和A280。計(jì)算樣品DNA濃度，判斷樣品濃度和DNA純度。第十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日DNA制備注意事項(xiàng)1.要顛倒搖動(dòng)試管懸浮沉淀，不可用槍頭(尤其是沒剪去槍頭尖端）吹打沉淀。2.吸上清槍頭使用前必須粗吸頭（微量移液槍的槍頭剪去尖端，并用火燒一下，使之圓鈍），避免機(jī)械剪切力對(duì)DNA鏈的損傷。3.為了獲得高分子量的DNA，操作中必須防止混勻、抽提及沉淀時(shí)劇烈機(jī)械震蕩造成的DNA的斷裂。4.如含有RNA,可用100ng/ml的RNase在37℃水解至少半小時(shí)。第十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日實(shí)驗(yàn)二.DNA濃度與純度的測(cè)定第十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日

DNA濃度的分光光度計(jì)測(cè)定原理：

核酸的紫外吸收堿基含有共軛雙鍵，使相關(guān)化合物在240-290nm的紫外波段有強(qiáng)烈的吸收峰，最大吸收值在260nm左右組成核酸分子的堿基，均具有一定的吸收紫外線特性，最大吸收值的波長(zhǎng)為250～270nm之間。實(shí)驗(yàn)原理第十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日OD260的應(yīng)用：DNA或RNA的定量:OD260=1.0相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈RNA20μg/ml單鏈寡聚核苷酸第十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0含雜蛋白及苯酚，OD260/OD280降低如果制備的DNA樣品A260/A280<1.7，說明樣品中含酶和蛋白質(zhì)過高，應(yīng)將樣品用酚、氯仿、異戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA；A260/A280>2，說明樣品中RNA過高，可用RNase消化后，用酚、氯仿、異戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA；如果樣品A260/A280為1.8~2.0，說明樣品中鹽的含量過高，樣品沉淀后應(yīng)用70%乙醇多洗一遍。也會(huì)出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況，所以有必要結(jié)合凝膠電泳等方法檢測(cè)有無RNA，或用測(cè)定蛋白質(zhì)的方法檢測(cè)是否存在蛋白質(zhì)。純凈的RNAA260/A280=2.0,提取的RNA樣品A260/A280應(yīng)大于1.80。RNA樣品含有蛋白質(zhì)會(huì)使A260/A280比值下降。第十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日實(shí)驗(yàn)步驟：以TE緩沖液為空白對(duì)照；將基因組DNA溶液分別用TE緩沖液稀釋50倍、80倍、100倍至4ml，分別測(cè)OD260和OD280；基因組DNA濃度為：OD260×核酸稀釋倍數(shù)×50（μg/mL）；樣品各稀釋級(jí)別算得的濃度平均值，即作為該樣品的實(shí)際DNA濃度。以O(shè)D260/OD280初步判斷提取基因組DNA的純度。第十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日1.為防止讀數(shù)漂移：選用TE緩沖液為溶劑（PH一定，離子強(qiáng)度低）合適的稀釋濃度，保證吸光值在0.1-1.5范圍內(nèi)混合要均勻，無氣泡和懸浮物，視窗干凈2.測(cè)定光吸收值時(shí)，用稀釋DNA樣品的溶液做對(duì)照。3.選擇稀釋要適當(dāng)，應(yīng)在檢測(cè)范圍之內(nèi)。紫外分光光度法只用于測(cè)定濃度大于0.25g/mL的核酸溶液。DNA定量注意事項(xiàng)第二十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日（二）DNA質(zhì)量與濃度的瓊脂凝膠電泳法測(cè)定

DNA帶負(fù)電荷，陰極→陽極DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。前者由分子所帶凈電荷量的多少而定，后者則主要與分子大小及其構(gòu)型有關(guān)。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)，在用電泳法測(cè)定DNA分子大小時(shí)，應(yīng)當(dāng)盡量減少電荷效應(yīng)。增加凝膠的濃度可以在一定程度上降低電荷效應(yīng)，使分子的遷移速度主要由分子受凝膠阻滯程度的差異所決定，提高分辨率。同時(shí)適當(dāng)減低電泳時(shí)的電壓，也可使分子篩效應(yīng)相對(duì)增加而提高分辨率。第二十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日

DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移率取決于：

1.DNA分子的大小

DNA遷移的速率與其堿基對(duì)數(shù)的常用對(duì)數(shù)成反比.2.瓊脂糖濃度越大，DNA遷移率越低

3.DNA的構(gòu)象超螺旋環(huán)狀>線狀>開環(huán)狀

4.凝膠中、電泳緩沖液中的溴化乙錠降低DNA的遷移率

第二十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日5.電壓：低電壓時(shí)，遷移率與電壓成正比適宜電壓：5-8V/cm6.電泳緩沖液：離子強(qiáng)度適中主要：TAE,TBE，TPEPH7.5-7.8第二十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日操作步驟瓊脂糖凝膠的制備：溶化，冷卻，EB(一)

根據(jù)被分離DNA的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量?？蓞⒄障卤恚涵傊悄z濃度％線性DNA的有效分離范圍／kb0.35—600.61—20O.70.8—10O.90.5—71.20.4—61.50.2—42.00.1—3

實(shí)驗(yàn)用1.2％瓊脂糖。稱取1.2g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入100mL1xTAE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化，取出搖勻即可。第二十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日樣品的制備：樣品+1/5體積溴酚藍(lán)加樣：加樣端為負(fù)極（黑）電泳：5V/cm觀察：紫外燈下觀察，照相第二十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日溶膠第二十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日凝膠冷卻至50°C，加EB至終濃度0.5μg/ml第二十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日(二)凝膠板的制備：取干凈的有機(jī)玻璃內(nèi)槽，將有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好(一定封嚴(yán)，不能留縫隙)。第二十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日加梳子，倒膠：將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子，將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面(注意不要形成氣泡)。第二十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日凝膠凝固后取出梳子第三十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日待膠凝固后，小心地拔出梳子，撕下透明膠帶，然后將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放在電泳槽內(nèi)。注意：DNA樣品孔應(yīng)朝向負(fù)電極一端。加緩沖液加電泳緩沖液至電泳槽中，加液量要使液面沒過膠面1-1.5毫米。第三十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日凝膠上樣緩沖液（6×）蔗糖40％溴酚藍(lán)0.25％

第三十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日點(diǎn)樣第三十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日電泳第三十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日注意觀察溴酚藍(lán)染液的遷移第三十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日紫外燈下觀察電泳結(jié)果第三十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日照相第三十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日電泳注意事項(xiàng)

1.瓊脂糖的質(zhì)量：瓊脂糖（agarose）是以質(zhì)量較好的瓊脂作原料制成的。瓊脂是由瓊脂糖和瓊脂膠組成的復(fù)合物。瓊脂膠是一種含有硫酸根和羥基的多糖。它具有離子交換性質(zhì)，這種性質(zhì)將給電泳帶來電滲作用的不良影響，因而必須去除干凈。所謂瓊脂糖的質(zhì)量不過關(guān)就是瓊脂糖內(nèi)含有較高比例的瓊脂膠。瓊脂糖是一種直鏈多糖，它由D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖的殘基交替排列組成的線性多聚糖。由于鏈狀瓊脂糖分子相互以氫鍵交聯(lián)，因此與瓊脂一樣能形成凝膠。瓊脂糖帶有親水性，不含有帶電荷的基因，不引起DNA變性，又不吸附被分離的物質(zhì)，因此它是一種很好的凝膠劑。第三十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日2.DNA分子的遷移率：影響DNA分子在電泳中的遷移率的因素是多方面的，除了決定于DNA分子大小與構(gòu)型外，還有瓊脂糖的濃度、電壓大小、緩沖液pH值和電泳時(shí)的溫度等。為了精確測(cè)定其分子量的大小，采用一下措施：(1)每次測(cè)定時(shí)，要有已知分子量的DNA片段作為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行對(duì)照。電泳。(2)選擇最合適的電泳條件。(3)提高分子篩效應(yīng)，降低電荷效應(yīng)。第三十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日3.EB染色：EB是核酸的顯色劑，使用EB對(duì)DNA染色的3種方法：(1)在制膠中與電泳緩沖液中同時(shí)加入EB。(2)只在膠中加入EB，在電泳緩沖液中不加。這樣可減少操作時(shí)雙手受EB污染的可能。(3)在電泳結(jié)束后，取出凝膠，放在含有EB的電泳緩沖液或DDW中浸染10-30分鐘。

EB為強(qiáng)誘變劑，劇毒，操作時(shí)要帶一次性手套，并在專區(qū)間操作。用過的手套要及時(shí)將手套順手翻過來，讓有EB的面朝里，有EB的廢液和器皿不能隨便丟棄，要用專門方法處理后丟棄。第四十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日DNA和RNA本身并不產(chǎn)生熒光，但在熒光染料溴化乙錠（ethidiunbromide,EB）嵌入堿基平面之間后，DNA樣品在紫外線照射激發(fā)下，可以發(fā)出紅色熒光，其熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度DNA溶液做標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，可以比較出被測(cè)DNA溶液的濃度。靈敏度可達(dá)1～10ng。EB見光易分解，故應(yīng)存棕色試劑瓶中于4℃條件下保存。染色時(shí)也應(yīng)避光。電泳后應(yīng)立即染色觀察或拍照記錄。若不能馬上拍照，可用保鮮膜或塑料袋封好置于4℃下過夜，核酸帶型改變不大。第四十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日染色一般是在凝膠或電泳緩沖液中加入終濃度為0.5μg/mL的EB，但是由于EB帶正電荷，中和核酸分子的負(fù)電荷，同時(shí)它的嵌入增加了核酸分子的剛性，使遷移率減慢，故不宜用于凝膠電泳測(cè)定核酸分子的大小。利用凝膠電泳比較估計(jì)或測(cè)定樣品DNA的含量，也不適合在凝膠中直接加入EB，因此在凝膠中，游離的EB分子向負(fù)極游動(dòng)，會(huì)使樣品中前后各帶染色不均勻，影響定量。故應(yīng)在電泳后，將凝膠浸入0.5μg/mL的EB水溶液中10min進(jìn)行染色。第四十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日4．溴酚藍(lán)指示劑緩沖溶液的作用：

含有50%蔗糖，可增加上樣DNA溶液的密度，以確保DNA樣品沉入點(diǎn)樣孔內(nèi)，起DNA電泳時(shí)的前沿指示劑作用。一般溴酚藍(lán)的電泳遷移位置相當(dāng)于300~400bp雙鏈線狀DNA。5．點(diǎn)樣量太高易產(chǎn)生拖尾與彌散現(xiàn)象，樣品遷移速度減慢。點(diǎn)樣量太少，分辨不清，影響結(jié)果。如果DNA已經(jīng)降解，DNA的帶就會(huì)拖尾巴，或出現(xiàn)彌散性分布，而不能形成清晰、緊湊的帶紋，這樣的DNA樣品不能用于進(jìn)一步研究。第四十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期日比較樣品DNA條帶與λDNA標(biāo)準(zhǔn)條帶的亮度即可對(duì)樣品DNA進(jìn)行定量。肉眼（±10ng），但通過圖像處理設(shè)備和凝膠分析軟件，分析，通過λDNA標(biāo)準(zhǔn)繪制出DNA量與條帶亮度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，估