人類體外受精■胚胎移植實驗室操作專家共識（完整版）指南概述體外受精-胚胎移植（IVF-ET）技術已在我國大陸地區(qū)發(fā)展27年，近15年來，該項技術迅速成長，大批生殖中心在各地陸續(xù)建成。2001~2003年，衛(wèi)生部主管部門頒布了一系列針對輔助生育技術的技術規(guī)范及管理辦法，使得該項技術走向規(guī)范化，得到健康發(fā)展。2005年12月，中華醫(yī)學會生殖醫(yī)學分會（CSRM）成立，進一步促進了該學科的學術發(fā)展。近些年來，中華醫(yī)學會生殖醫(yī)學分會各方面專家在臨床、實驗室方面均積累了豐富的經(jīng)驗，形成了獨特的見解。為了進一步規(guī)范IVF實驗室操作，為患者提供更優(yōu)質(zhì)的臨床醫(yī)療服務，學組根據(jù)國內(nèi)夕卜發(fā)表的文獻和國內(nèi)實驗室專家意見，并參考了美國生殖醫(yī)學協(xié)會和歐洲生殖醫(yī)學會的相關指南，制定本指南。由于專業(yè)的特點，目前國內(nèi)外的臨床胚胎實驗室相關指南大量觀點證據(jù)級別均較低，或者無循證證據(jù)。因此按照CSRM指南共識編寫手冊的分類，本指南為正式的專家共識指藏本指南的適用范圍為我國已經(jīng)正式實施IVF-ET技術的生殖中心，在為不育患者實施IVF-ET治療中，臨床胚胎學家進行的人類配子和胚胎操作。制定本指南的目標是協(xié)助各個實驗室制定自己的標準操作程序，從而獲得更加穩(wěn)定的臨床結局，減少差錯發(fā)生。IVF-ET實驗室操作的關鍵問題一、配子與胚胎的總體操作原則IVF實驗室內(nèi)負責管理工作的臨床胚胎學家，應該針對所有配子或胚胎進行的操作制定標準操作程序，并應該按照該標準操作程序培訓下級臨床胚胎學家。所有操作方法應該簡便、安全、可靠。胚胎培養(yǎng)室還應遵循無菌、無毒、無味、無塵的原則。新裝修胚胎培養(yǎng)室啟用前需要做鼠胚試驗，鼠胚試驗合格后才能投入使用。胚胎培養(yǎng)室還應該有UPS電源，以保障24h不間斷供電。除冷凍復蘇等特定操作外，操作與觀察過程應該保持配子或胚胎處于37°C的溫度、40%?60%濕度的環(huán)境下。IVF實驗室內(nèi)的空氣質(zhì)量情況會明顯影響胚胎的發(fā)育潛能，建議采取適當?shù)拇胧└纳茖嶒炇业目諝赓|(zhì)量，特別是能夠去除空氣中VOC的凈化系統(tǒng)。所有操作應該符合無菌原則；所有配子或胚胎操作應該在百級潔凈區(qū)域內(nèi)進行。所有配子或胚胎的培養(yǎng)皿、試管等應該在放入配子或胚胎前標注患者姓名。不應該在同一操作區(qū)域內(nèi)同時操作兩位或多位患者的配子或胚胎。應該將一位患者的樣本完全處理完并放置入培養(yǎng)箱或液氮容器后再處理下一位患者的樣本。不同的容器間轉移配子或胚胎前，應該核對兩個容器上的患者姓名標識。所有接觸患者配子或胚胎的耗材、試劑需要經(jīng)過精子存活實驗后方可使用，有條件者建議進行鼠胚試驗。所有接觸患者配子或胚胎的耗材（培養(yǎng)皿、巴斯特管、吸管、加樣器頭、取卵針、移植管等），只能一次性使用，使用后按醫(yī)用垃圾處理。對配子或胚胎進行的操作時應該進行雙人復核。具體的每一步操作過程，應該有紙質(zhì)和電子記錄保存，以備日后查驗。詳細記錄每個病人所用的試劑、耗材批號。二、 取卵及撿卵IVF實驗室的胚胎學家在取卵前應與臨床醫(yī)生核對患者信息，在臨床醫(yī)師對患者實施取卵術時，應該同步進行撿卵操作。由于卵母細胞在長時間處于低于體溫的環(huán)境下受精能力將下降，非整倍體幾率增加，因此，在取卵過程中，應從患者卵巢內(nèi)抽出的卵泡液應由負壓吸引器直接吸入37°C恒溫試管架上的無菌試管中。取出的卵泡液應該保持在37C左右的環(huán)境下，盡快在體視鏡下識別卵冠丘復合物，通過輕柔吹打、洗滌的方法去除卵冠丘復合物周圍的血液、血凝塊和卵泡液成分。以盡可能減少開啟培養(yǎng)箱次數(shù)、盡可能縮短在培養(yǎng)箱外停留時間為原則，將卵冠丘復合體移至培養(yǎng)箱，記錄所用培養(yǎng)液批號、取卵者及揀卵者姓名、培養(yǎng)箱號、卵冠丘復合物形態(tài)評估情況以及撿卵核對者的姓名等。三、 精液處理所有患者夫婦在進行IVF治療之前，應該進行精液常規(guī)分析，分析推薦采用WHO第5版的標準。除特殊情況外，男性配偶應該在取卵前2?7d排精一次。精液收集在無菌、無毒性的取精杯中，并在取精杯上注明患者夫婦姓名及編號。取精后盡快將取精杯送入精液處理室，建議在1h內(nèi)開始處理。精液處理應該在室溫下進行。精液處理的目的是去除精漿以及精液中的污染物、雜質(zhì)和異常精子，并使精子獲能。精液處理過程中應該記錄取精方法、精液的量、顏色、液化情況等基本參數(shù)。如院外取精，或者在采集精液過程中發(fā)生特殊情況，應該予詳細記錄。目前暫無統(tǒng)一的精液處理方法，可根據(jù)各中心經(jīng)驗和精液樣本質(zhì)量選擇優(yōu)選方法。不管采用何種方法，反復長時間離心可能會導致精子的損傷。處理過程（每步時間、操作者等）及處理后的精子濃度、活率，應該記錄備案。常用精液處理方法為密度梯度離心法或上游法，但對濃度極低的精液樣本，建議僅洗滌1~2次后備用，以卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）方式授精。1.液化不良精液處理：對液化不良的精液，建議在離心前，用無菌注射器吹吸混勻，或巴氏吸管反復吹打混勻，混勻后讓未液化團塊自然沉淀后棄去，再對樣本進行密度梯度離心。2.上游法：上游法處理精液，推薦直接將原精液樣本置于培養(yǎng)基下層，收集上層懸液。不建議先與培養(yǎng)基混勻離心后再上游的處理方式。3.密度梯度離心法：相對上游法處理精液，密度梯度離心處理后精子的回收率較高。上游法和密度梯度離心法都會顯著降低凋亡精子的比例。四、自然受精.自然受精的加精時間：HCG注射后38?40h加精，受精率較為理想。加精時應該雙人核對并記錄時間、加精量。加精濃度在很大的一個范圍內(nèi)，獲得的受精率類似，在30~50pl的液滴內(nèi)加精5000?10000條，或在1ml的培養(yǎng)液內(nèi)加精15萬?30萬條。但過高的加精濃度可能導致多精受精率升高和培養(yǎng)體系生化環(huán)境下降，因此可能有害。2.精卵共培養(yǎng)時間：常規(guī)受精：將精卵共培養(yǎng)18?20h;短時受精：縮短精卵共培養(yǎng)至1?6h（短時受精僅指縮短共培養(yǎng)時間，不包括剝除卵冠丘復合物的顆粒細胞）。短時受精縮短了精子與卵母細胞共培養(yǎng)的時間，能夠改善臨床妊娠率。短時受精周期中，多原核發(fā)生可能與患者年齡有關。短時受精周期中，多原核發(fā)生率對臨床妊娠結局的影響尚不明確。與常規(guī)受精相比，短時受精的可移植胚胎率及優(yōu)質(zhì)胚胎率更高。五、ICSIICSI適應癥：除了原衛(wèi)生部頒布的《衛(wèi)生部關于修訂人類輔助生殖技術與人類精子庫相關技術規(guī)范、基本標準和倫理原則的通知》中的適應癥之外，對于前次IVF多精受精比例較高、沒有獲得足夠可移植胚胎的患者，再次治療可以考慮ICSI。解凍睪丸精子行ICSI，能得到與新鮮睪丸精子類似的受精結局。ICSI之前需要用透明質(zhì)酸酶和機械的方法去除顆粒細胞，在此過程中，應該盡量減少卵子接觸酶的時間，機械去除顆粒細胞的過程中應該使用適當口徑的巴斯特管，盡量減少吹吸次數(shù)，從而減少機械刺激的應激。透明帶明顯異常的卵母細胞自然受精能力下降，采用 ICSI方式授精能明顯改善受精結局。在經(jīng)過常規(guī)卵巢刺激后，獲得的未成熟卵母細胞常常存在染色體異常，未表明對這些卵進行ICSI能改善結局。如經(jīng)過卵巢刺激獲卵均為MI期停滯的卵細胞，行體外成熟培養(yǎng)(IVM)結局不良。HalfICSI:部分卵子ICSI(HalfICSI)作為可疑受精困難者的備選，在一定程度上預防IVF完全受精失敗。ICSI操作過程中，可以考慮采用PVP等液體來降低操作難度，但要盡量減少注入卵母細胞的PVP的量。影響ICSI受精率的最重要的因素包括：卵母細胞的質(zhì)量和成熟度、精子質(zhì)量及制動情況、破膜的情況。在操作人員技術熟練的基礎上，受精率低或卵母細胞退化率高的最可能原因是卵母細胞的質(zhì)量差或成熟度不良。應該盡一切可能選擇活動精子制動后注射，制動過程如果不充分（未劃破精子尾部細胞膜）將影響受精率。如全部精子均為不動精子，可以考慮在ICSI操作中使用睪丸精子、經(jīng)低滲處理的精子或者在精子中加入精子激動劑。ICSI后應該在記錄中記錄卵母細胞和精子的情況、操作過程、操作者、所用培養(yǎng)液及耗材詳情。六、早期補救性ICSI短時受精結合早剝除卵冠丘復合物顆粒細胞（早拆卵），以極體排出（卵子激活）判斷受精發(fā)生，如卵子激活完全失敗或卵子激活發(fā)生率低于一定比例時，在加精時間短于8h行補救ICSI稱早期補救ICSI。短時受精（早拆卵）聯(lián)合早期補救性ICSI對常規(guī)IVF周期完全受精失敗患者的臨床結局有明顯改善，早期補救ICSI后妊娠的出生結局及新生兒狀況與采用射精精液的ICSI后出生結局無統(tǒng)計學差異。早期補救性ICSI周期出生嬰兒的性別比無偏差，出生體重正常，無嚴重出生缺陷。但目前還缺乏長時間的隨訪的結果，因此臨床醫(yī)生可以考慮對這類患者進行短時受精聯(lián)合早期補救性ICSI。七、胚胎培養(yǎng)常規(guī)受精結束或ICSI后應該更換培養(yǎng)液及培養(yǎng)皿，隨后在IVF授精或ICSI后16?18h之間觀察受精情況，記錄原核形態(tài)、數(shù)量。胚胎培養(yǎng)時間點設置：根據(jù)2011年版ES-HERE發(fā)布的Istanbul共識設置胚胎觀察時間點。由于各實驗室培養(yǎng)體系不同、操作方法不同，胚胎發(fā)育速度不一致。因此，學組建議各中心應在Istanbul共識的時間點基礎上找出符合各自中心最佳觀察點。雖然多原核的胚胎依然有繼續(xù)發(fā)育甚至妊娠的可能性，但多原核胚胎有導致滋養(yǎng)細胞疾病的可能，不應該用于移植和冷凍。人類胚胎對外部應激非常敏感，不良應激會導致細胞代謝異常，影響細胞功能和基因表達。因此，胚胎體外培養(yǎng)的核心工作應該著眼于使胚胎時刻保持在合適的pH值、溫度、滲透壓等指標的環(huán)境中，以利于胚胎保持穩(wěn)態(tài)。胚胎的觀察應該注意卵裂球數(shù)量、碎片所占的百分比、細胞大小的均一性及排列、胞漿顏色以及多核現(xiàn)象等。推薦參考Istanbul共識中的胚胎評分方法，針對每一枚卵裂期胚胎，形態(tài)學評分應包含三個方面信息：卵裂球數(shù)、級別以及評為這個級別的原因。胚胎培養(yǎng)記錄中應詳細記載所用培養(yǎng)液的品種、批號、培養(yǎng)箱的情況、操作人員等詳情。八、胚胎移植1.移植胚胎數(shù)目：我國衛(wèi)生行政部門已經(jīng)有明確的法規(guī)限制了移植胚胎的數(shù)量，但是對于瘢痕子宮、雙子宮等畸形子宮、宮頸內(nèi)口松弛、身高過于矮小等高?；颊?，移植2枚胚胎將會對母嬰造成很大的安全風險，建議進行單胚胎移植。2.移植胚胎選擇：相對而言，卵裂球數(shù)量比卵裂球均一情況及胚胎碎片含量更能預測胚胎的發(fā)育能力；散在的胚胎碎片比集中的胚胎碎片更加影響胚胎著床；卵裂球內(nèi)是否存在多核現(xiàn)象顯著影響胚胎的著床率。除了形態(tài)學選擇外，測定胚胎的氨基酸代謝情況等生化檢測指標、胚胎分泌的微量HCG等方法，也可以考慮作為一種無創(chuàng)選擇胚胎的手段。移植方法：應該使用一次性移植導管。超聲引導下移植使手術更加精準，并保證穩(wěn)定的妊娠率。在裝載移植管時務必雙人核對，在將含胚胎的移植管置入患者宮腔之前，應該雙人核對患者姓名。移植記錄：移植記錄應該詳細記載胚胎數(shù)目、形態(tài)學評分、移植時間、移植過程中導管置入深度、出血的情況、以及臨床醫(yī)師和臨床胚胎學家的姓名。九、囊胚培養(yǎng)囊胚培養(yǎng)的主要目的是對胚胎進行自然選擇。對于部分患者而言，囊胚培養(yǎng)移植可能改善她們的臨床妊娠率。囊胚培養(yǎng)可以等待PGD結果出具，利于篩選移植胚胎。囊胚培養(yǎng)增加了胚胎在體外的培養(yǎng)時間，也增加了不利因素影響的風險。由于囊胚的營養(yǎng)需求與卵裂期胚胎有差異，因此囊胚培養(yǎng)過程中通常采取一些特殊的條件。目前較多采用序貫培養(yǎng)液進行囊胚培養(yǎng)，但這并非唯一方案。另外低氧培養(yǎng)、集合培養(yǎng)也有可能利于囊胚形成。如果進行囊胚培養(yǎng)，應該具備良好的培養(yǎng)條件。目前大多數(shù)中心按照Gardner囊胚分級法對形成的囊胚進行分級。在此基礎上，為了消除工作人員之間在評分方法上的差異，推薦采用更為細化和客觀化的評分手段：擴張之后的囊胚因為囊胚腔明顯擴大，內(nèi)細胞團與滋養(yǎng)層清晰，而且囊胚在此階段發(fā)育的時間較長，因此在此發(fā)育階段進行形態(tài)學評分更客觀可靠；可以在擴張囊胚的中部最大直徑平面（“赤道面'）上以及囊胚最貼近培養(yǎng)皿的底面上分別聚焦后觀察滋養(yǎng)細胞和內(nèi)細胞團。雖然滋養(yǎng)細胞層將來并不發(fā)育成胎兒，但其形態(tài)對于囊胚的進一步發(fā)育和著床有著非常重要的意義。D5和D6形成的囊胚均可進行移植或冷凍，D5的囊胚著床率高于D6的囊胚。不同來源的精子受精后的胚胎，形成囊胚的比例和質(zhì)量可能存在差異。D3的優(yōu)質(zhì)胚胎，囊胚形成率較高，而且囊胚質(zhì)量較好。囊胚培養(yǎng)移植可能會增加移植取消率。囊胚培養(yǎng)記錄中應該包含培養(yǎng)箱、培養(yǎng)液的情況，并記錄囊胚形成的時間。十、配子及胚胎冷凍每個生殖中心實驗室均應該建立可靠的冷凍保存技術，冷凍過程及放入液氮灌的儲存位置時應雙人核對。冷凍方法：雖然玻璃化冷凍技術中采用的冷凍保護劑濃度更高，可能帶來胚胎毒性的風險，但玻璃化冷凍的卵母細胞、卵裂期胚胎和囊胚復蘇率均明顯優(yōu)于程序冷凍技術。且從目前國內(nèi)外獲得的短期隨訪數(shù)據(jù)看來，玻璃化冷凍復蘇的胚胎，移植后出生的新生兒，出生缺陷無明顯增加，身長體重也未見明顯異常。因此推薦采用玻璃化冷凍技術進行胚胎的冷凍。卵母細胞冷凍：目前卵母細胞冷凍技術上不完全成熟，效率較低，建議僅用于因醫(yī)學原因無法在取卵日受精的患者°HCG后36h取卵取卵后2h玻璃化冷凍卵母細胞的復蘇率顯著高于取卵后5~6h冷凍的卵母細胞，因此建議在取卵后2h左右進行冷凍。冷凍復蘇后的卵母細胞，紡錘體在2~3h重建，線粒體的膜電位2h后恢復，因此建議在復蘇2?3h后進行ICSI。胚胎冷凍：移植剩余的胚胎，可以考慮按照一定的質(zhì)量標準選擇后，進行胚胎冷凍。發(fā)育速度過慢或質(zhì)量太差的胚胎，不論是卵裂期胚胎還是囊胚，其復蘇后存活率和著床率都會顯著降低。每個冷凍容器內(nèi)的胚胎數(shù)量推薦結合擬復蘇移植的胚胎數(shù)量和所在中心的復蘇率來確定。玻璃化冷凍液中的平衡時間明顯影響胚胎復蘇率以及復蘇后的發(fā)育能力，平衡時間的長短應該與溫度相適應：溫度越高（37。0,平衡時間越短；溫度較低（〃室溫”），平衡時間應該適度延長。擴張較充分的囊胚冷凍復蘇后存活率較好，建議這些胚胎在進行玻璃化冷凍前應進行人工皺縮排出囊胚腔內(nèi)的液體。復蘇后胚胎存活的情況，可以根據(jù)胚胎形態(tài)和繼續(xù)培養(yǎng)過程中胚胎發(fā)育情況來綜合判斷。能進一步發(fā)育的胚胎預后良好。卵裂期胚胎，如果復蘇后有部分卵裂球發(fā)生損傷，提示胚胎發(fā)育潛能不良，不利于后續(xù)的臨床結局。冷凍記錄：應該包括冷凍方法、每個容器內(nèi)的胚胎數(shù)量、發(fā)育階段、形態(tài)學評分、在液氮容器內(nèi)的儲存位置。為保證冷凍中的配子或胚胎的安全，應該監(jiān)測液氮容器內(nèi)的液氮液面位置，建立完善的冷凍管理制度。十一、輔助孵出輔助孵出應用于新鮮周期移植的價值一直存在爭議，目前的證據(jù)不推薦對所有移植的胚胎進行輔助孵出。而對于那些臨床預后較差的患者，如反復植入失敗、胚胎質(zhì)量較差、胚胎透明帶異常的胚胎以及高齡的患者（＞38歲），輔助孵出可能改善種植率。通過時差成像技術觀察，發(fā)現(xiàn)復蘇胚胎（尤其是復蘇囊