第四章環(huán)境化學(xué)物的一般毒性及其評價第一節(jié)化學(xué)物毒性評價的實驗基礎(chǔ)一、實驗動物的選擇實驗動物是指經(jīng)人工培育，對其攜帶微生物實行控制，遺傳背景明確，來源清楚，可用于科學(xué)研究的動物。物種選擇種類選擇的依據(jù)：對化合物的毒性反應(yīng)及代謝過程與人相似；自然壽命不太長；易于飼養(yǎng)和實驗操作；經(jīng)濟(jì)并易于獲得已知生理指標(biāo)的數(shù)量、繁殖性能、已知的藥理與生理特性等。以選擇哺乳動物為主?？刹捎?－3種，嚙齒類和非嚙齒類。常用大鼠、小鼠、豚鼠、家兔和狗，尤以大鼠使用很多。家兔或豚鼠常用于研究化合物的皮膚毒性，包括對粘膜的刺激。貓、狗也用于急性毒性試驗，但因價貴不易于大量使用。豬為雜食動物，對一些化合物的生物效應(yīng)表現(xiàn)與人有相似之處，尤其是皮膚結(jié)構(gòu)與人較近似，適合研究經(jīng)皮對人的危害。靈長類在物種上與人類接近，但因體大、價貴，不便大量使用。此外還可選用某些昆蟲（蜜蜂）或水生生物。（二）品系選擇品系指計劃交配的辦法獲得的起源于共同祖先的一群動物。同一品系的動物具有共同的遺傳來源、相似的外貌特征、獨特的生物學(xué)特性及穩(wěn)定的遺傳性能。1、近交系動物指采用連續(xù)20代以上兄妹交配或親子交配而培育的純品系動物。遺傳上高度一致，基因純合度可達(dá)98.6-99.8%。優(yōu)點：個體差異小，消耗實驗動物少；結(jié)果易于重復(fù)和定量比較；組織相容性一致。近交系特點：

a.實驗結(jié)果比較準(zhǔn)確，可以避免遺傳組成不同或個體差異太大等所引起的誤差。

b.實驗結(jié)果的平均性較一致。因此每組僅用較少數(shù)的動物，即能看出顯著性來。

c.實驗結(jié)果的重復(fù)性較大，因此，一次實驗結(jié)果即具有實際意義，可以減少重復(fù)實驗，縮短實驗時間。

e.易于獲得預(yù)期結(jié)果，近交系動物遺傳背景明確，對每個品系的生物學(xué)特性、生理學(xué)特點、易感病原等都有完整的背景材料。

f.近交衰退，生活力弱，對生產(chǎn)環(huán)境要求高、產(chǎn)仔少、營養(yǎng)要求高。是胚胎學(xué)、生理學(xué)、遺傳學(xué)研究的理想材料，也用于藥效試驗、安全評價等的動物實驗。進(jìn)行組織或腫瘤移植實驗時，制作某些有遺傳因素的人類疾病的動物模型時，近交系是必不可少的材料。2、突變系動物在生長繁殖過程中，通過自然突變或人工定向突變的方法，使其某基因發(fā)生突變并喪失原有的正常功能。這種突變的基因可以世代相傳并保持遺傳基因特性的品系動物，稱為突變系動物。在習(xí)慣上，突變系動物主要是指發(fā)生后一種的變異的動物。遺傳物質(zhì)發(fā)生突變，主要有如下幾種情況：

●可見突變，動物發(fā)生了可由肉眼觀察到的變異。如，基本沒有被毛及胸腺發(fā)育不全的裸小鼠、裸大鼠等。

●生化突變，動物的某一生化功能發(fā)生改變，甚至喪失。如嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠。

●致死性或條件致死性突變，致死性突變有顯性和隱性兩種，如鐮狀紅細(xì)胞貧血癥就是隱性致死性突變。也有一些致死性突變，在某種條件下動物可以存活，缺乏這種條件動物則會致死。

突變系動物主要應(yīng)用于：

●遺傳機制的研究，如作染色體的基因定位等;

●人類疾病的動物模型，是這類型動物的最主要的應(yīng)用領(lǐng)域。有些突變使動物的免疫系統(tǒng)功能改變，有的使內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)功能發(fā)生改變。從而為醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究，提供了在實驗動物身上復(fù)制各種人類疾病并加以研究的可能。

●突變系動物還可以用于其他的領(lǐng)域，如，利用免疫缺陷動物作環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測等。3、雜交群動物指兩個不同近交系之間有目的地進(jìn)行交配所產(chǎn)生的第一代動物。特點：

a.個體間遺傳均一近交系間F1雜種與其它雜種一沒，個體間遺傳變異與近交系一樣很小，其基因位點均為雜合型（近交系為純合型），因此能取得一致的實驗結(jié)果。

b.表現(xiàn)雙親的顯性性狀

c.環(huán)境適應(yīng)性強F1雜種對環(huán)境變化的緩沖機能和自我調(diào)節(jié)能力都比近交系高。

d.具有雜種優(yōu)勢F1雜種具有雜種優(yōu)勢的特點，如體質(zhì)健壯、生長快、易于飼養(yǎng)管理、發(fā)育均勻、手術(shù)后恢復(fù)快等優(yōu)點。4、封閉群動物指在5年以上不從外部引進(jìn)新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所保存繁殖的動物群。個體間具有一定程度的遺傳學(xué)差異。封閉群動物個體間差異的大小，取決于祖代的來源。若來源于近交系的繁殖群，但群內(nèi)不按兄妹近親交配，而用隨機交配的方式保種并繁殖生產(chǎn);另一類是來源于非近交系動物群體，前者個體間差異小，后者差異大。封閉群動物在遺傳上具有一定的雜合性，因而這類動物繁殖力高，適應(yīng)能力強，保種及繁殖生產(chǎn)的成本較低，應(yīng)用范圍廣。與近交系相比，封閉群動物的個體在遺傳上仍存在相當(dāng)?shù)牟町?，因此實驗的可重?fù)性，及反應(yīng)的一致性就不如近交系動物。但是，封閉群動物在實驗中，卻有比近交系更接近自然種群反應(yīng)的特點。所以在實際中，封閉群動物被廣泛地應(yīng)用于教學(xué)、預(yù)實驗、一般的藥物初篩、以及毒性、安全性評價試驗之中。（三）微生物控制的選擇1、無菌動物germfreeanimal,GF指體內(nèi)外均無任何微生物和寄生蟲的動物。經(jīng)人工剖腹產(chǎn)凈化培育而來。無菌動物在自然界并不存在，必須用人為的方法養(yǎng)育而成。一般將臨產(chǎn)前的健康動物用麻醉藥品或拉斷頸椎處死后，立即浸泡在37℃滅菌液中，送進(jìn)無菌室（或無菌隔離器），按無菌手術(shù)進(jìn)行剖腹，切除帶胎子宮（子宮內(nèi)首先應(yīng)無菌），將其浸入消毒液里并立即輸送到另一只隔離器中，切開子宮取胎，經(jīng)用滅菌紗布揩拭仔體并斷臍（電刀切斷）后，放入隔離器內(nèi)人工喂乳或用其他品系的無菌雌鼠作保姆代養(yǎng)。象小鼠和大鼠等用人工喂乳非常麻煩，故采用保姆代養(yǎng)。而象豚鼠因在一定程度上能自力飲乳，故人工哺乳較容易。另外，象禽類、魚類、昆蟲類等，因是在卵中無菌的前提下作出的，故用藥物將卵周圍滅菌后移入滅菌隔離器內(nèi)使其孵化即可，而且，這些動物，一般在出生后就能自力采食，故較易育成。2、悉生動物gnotobioticanimal,GN指體內(nèi)帶有已知微生物的動物。是經(jīng)人工有計劃地將已知菌投入動物體內(nèi)。例如使大腸桿菌定居在無菌小鼠體內(nèi)，在進(jìn)行微生物檢查時，僅能檢出大腸桿菌。亦有人工投給二種以上的已知微生物。悉生動物一般分為單菌（Monoxenie）、雙菌（Dixenie）、三菌（Trixenie），或多菌（Polyxenie）動物。此種動物同無菌動物一樣是放在隔離器內(nèi)飼育的，但因其帶有已知的微生物，故隔離器內(nèi)有微生物及其代謝產(chǎn)物的污染。例如，人工投給的微生物，除可在飲水中增殖外，還能在隔離器內(nèi)放出大量的氨氣。悉生動物應(yīng)用在許多微生物學(xué)研究上是一個突出的例子。只有選用悉生動物，才有可能了解到單一微生物和抗體之間的關(guān)系。多種微生物存在于同一機體內(nèi)，可以觀察微生物與微生物之間及機體之間相互關(guān)系和菌群失調(diào)的現(xiàn)象。當(dāng)對某種悉生物施于物理、化學(xué)等其它致病因子時則可觀察機體、微生物、致病因子三方面相互作用關(guān)系。3、無特定病原體動物specificpathogenanimal,SPF指體內(nèi)無特定的微生物和寄生蟲的動物。即無傳染病的動物，容許攜帶非特定微生物。故實際上是指無傳染病的健康動物。這類動物是目前國外使用最廣泛的實驗動物，它的來源，既可來自無菌動物繁育的后裔，亦可經(jīng)剖胎取后，在隔離屏障設(shè)施的環(huán)境中，由SPF親代動物撫育。它不帶有對人或動物本身致病的微生物，但不能排除可經(jīng)胎盤屏障垂直傳播的微生物?！癝PF”一詞的含義是不明確的，因為在特定條件下，“非”病原體是可以成為病原體的。而且有些病原體目前缺乏有效的檢查手段。“SPF”是多年來使用的名稱。目前還沒有更好的統(tǒng)一的名稱，所以仍沿用。4、清潔動物也稱最低限度疾病動物，動物體內(nèi)外不攜帶人畜共患疾病的病原體或動物傳染病病原體。是根據(jù)我國實驗動物發(fā)展需要而設(shè)立的一個比普通動物要求高的微生物及寄生蟲控制等級。要求動物不帶有一些傳染病的病原微生物，及常見的體內(nèi)寄生蟲，如：清潔級小鼠，要排除8種細(xì)菌、5種病毒、7類寄生蟲;清潔級大鼠，不應(yīng)攜帶8種細(xì)菌、2種病毒、7類寄生蟲，實驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)有具體的規(guī)定。清潔級動物的引種應(yīng)來源于更高等級的動物，應(yīng)在溫、濕度可控的亞屏障系統(tǒng)中，進(jìn)行飼養(yǎng)、繁殖生產(chǎn)或使用。所使用的籠具、墊料、器具、飼料和飲水等，應(yīng)當(dāng)實行滅菌處理，動物設(shè)施應(yīng)分區(qū)域設(shè)置，設(shè)計應(yīng)符合人流、物流防止交叉感染和方便工作的原則，要建立嚴(yán)格管理制度和操作規(guī)范。清潔級動物已是我國目前主要使用的質(zhì)量控制等級的動物，已被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究、新藥研制和安全評價等領(lǐng)域的動物實驗之中，發(fā)揮了清潔級動物，易于質(zhì)量控制，非實驗因素干擾少，有較好的敏感性和可重復(fù)性的優(yōu)點。（四）個體選擇1、年齡取決于實驗類型。急性實驗——成年動物；亞慢性、慢性實驗——較年幼或初斷乳動物。在實際工作中常以動物體重粗略判斷動物的年齡。各組動物的年齡應(yīng)盡可能保持一致。2、性別不同性別的實驗動物對化學(xué)物毒性的敏感程度有時會不同。一般選用雌雄兩性。3、生理狀態(tài)一般選用未產(chǎn)未孕的雌性動物。雌雄分養(yǎng)。4、健康狀況應(yīng)選用健康動物。一般試驗前檢疫觀察5－7天。二、常用染毒方法（一）經(jīng)口染毒1、灌胃是將液態(tài)受試化合物或固態(tài)、氣態(tài)化合物溶于某種溶劑中，配制成一定濃度，裝入注射器等定量容器，經(jīng)過導(dǎo)管注入胃內(nèi)。優(yōu)點：劑量準(zhǔn)確缺點：工作量大；可能損傷食道或誤入氣管；與人的接觸方式差異很大。灌胃體積：在每一試驗系列中，同物種實驗動物灌胃體積最好一致，即以單位體重計算所給予的毫升數(shù)應(yīng)一致，即ml/kg或ml/g計。這是因為成年實驗動物的胃容量與體重之間有一定的比例。按單位體重計算灌胃液的體積，受試化合物的吸收速度相對較為穩(wěn)定。小鼠一次灌胃體積在0.21.0ml/只或0.10.5ml/10g體重較合適，大鼠一次灌胃體積不超過5ml/只(通常用0.51.0ml/100g體重)，家兔不超過10ml/2kg體重，狗不超過50ml/10kg體重。2、吞咽膠囊將一定劑量受試化合物裝入藥用膠囊內(nèi)，強制放到動物的舌后后咽部迫使動物咽下。家兔及貓、狗等大動物可用此法。優(yōu)點：劑量準(zhǔn)確，尤其適用于易揮發(fā)、易水解和有異味的化合物。3、喂飼將化合物拌入飼料和水中，需計算每日進(jìn)食量和飲水量，折算攝入劑量。優(yōu)點：符合人接觸化合物的方式缺點：可能拒食；揮發(fā)性化合物可使攝入量下降，且有經(jīng)過呼吸道吸入的可能；化合物易水解或與食物中的化學(xué)成分起反應(yīng)。（二）經(jīng)呼吸道染毒1、靜式吸入在固定體積的密閉容器中，加入定量的易揮發(fā)液態(tài)化合物或氣態(tài)化合物。將動物置于其中，一般2h。尤其是適用于小動物接觸易揮發(fā)液態(tài)化合物的急性毒性研究。優(yōu)點：設(shè)備簡單；操作方便；消耗化合物少缺點：柜內(nèi)空氣組成、環(huán)境條件不穩(wěn)定；化合物濃度難以恒定。為保障試驗順利進(jìn)行，染毒柜體積、放置動物種類和數(shù)量及放置時間相互關(guān)系見表5-1。表5-1實驗動物最低需氣量及不同體積染毒柜應(yīng)放置動物數(shù)關(guān)系動物種屬呼吸通氣量(L/小時)最低需氣量(L/小時)不同容積染毒柜放置動物數(shù)(只)25L50L100L300L小鼠大鼠1.4510.182.4530.53~56~1012~151~236~405~6濃度計算：C=a.d/L×1000×1000（mg/m3）a－加入化合物量（ml），d－比重，L－容積（L）。2、動式吸入染毒柜——空氣流動、面罩吸入——避免化合物經(jīng)皮吸入優(yōu)點：劑量準(zhǔn)確缺點：裝置復(fù)雜；消耗大；可能造成污染（三）經(jīng)皮膚染毒第二節(jié)急性毒性及其評價方法一、急性毒性的概念急性毒性（acutetoxicity）是指機體(人或?qū)嶒瀯游?一次(或24小時內(nèi)多次)接觸外來化合物之后所引起的中毒效應(yīng)。觀察期可在1－7天。實驗動物發(fā)生中毒效應(yīng)的速度和強度不同，短者在接觸致死劑量的幾分鐘之內(nèi)，就可發(fā)生中毒癥狀，甚至死亡，長者則在幾天后才顯現(xiàn)中毒癥狀和死亡，即遲發(fā)死亡。此外，實驗動物接觸化合物的方式或途徑不同，“一次”的含義也有所不同。凡經(jīng)口接觸和各種方式的注射接觸，“一次”是指在瞬間將受試化合物輸入實驗動物的體內(nèi)。而經(jīng)呼吸道吸入與經(jīng)皮膚接觸，“一次”是指在一個特定的期間內(nèi)實驗動物持續(xù)地接觸受試化合物的過程，所以“一次”含有時間因素。實驗?zāi)康?.求出受試化合物對一種或幾種實驗動物的致死劑量(通常以LD50為主要參數(shù))，以初步估計該化合物對人類毒害的危險性。2.闡明受試化合物急性毒性的劑量－反應(yīng)關(guān)系與中毒特征。3.研究化合物在機體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)運和生物轉(zhuǎn)化過程及其動力學(xué)變化。也可用于研究急救治療措施。4.為亞急性、慢性實驗設(shè)計提供依據(jù)二、急性毒性評價方法（一）經(jīng)典的急性致死性毒性試驗1、實驗動物選用成年健康動物，常用大鼠和小鼠。各劑量組雌：雄＝1：1，出生2－3個月，體重小鼠1825g、大鼠180240g、豚鼠200250g、家兔22.5kg、貓1.52.0kg。數(shù)量10－20只最佳。大動物每組6只。實驗前至少觀察一周，選取其中健康動物，隨機分組。2、染毒劑量設(shè)計（1）查閱文獻(xiàn)：首先了解分析受試化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和其理化性質(zhì)，確定其所屬已知化合物或其衍生物的種類，有何特殊基團(tuán)及其分子量、熔點、沸點、比重、閃點、揮發(fā)度、蒸氣壓、水溶性和脂溶性等，依此查閱文獻(xiàn)，找出與受試化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)近似的化合物的毒性資料，并以其LD50(LC50)值作為受試化合物的預(yù)其毒性中值。但應(yīng)注意，一定是相同動物種系和相同接觸途徑。試驗：以文獻(xiàn)LD50為中值，取倍差，設(shè)3－4個梯度，找出大致的LD10-90的范圍。正式試驗：I＝（logLD90－logLD10）/（n-1）組距，即相鄰兩個劑量組對數(shù)差或相鄰組比值的對數(shù)值。一般設(shè)5－7個劑量組。設(shè)立對照組平行對照：不處理組，動物數(shù)目相等，各條件盡量一致。正對照：實驗組—溶液，對照組－溶劑。負(fù)對照組：不給任何物質(zhì)。自身對照：對照和處理實驗都在同一動物體內(nèi)進(jìn)行。用處理前的數(shù)據(jù)作為對照，處理后的數(shù)據(jù)作為實驗結(jié)果，這樣可排除生物間的個體差異。但受時間影響的指標(biāo)或需處死動物后才能測定的指標(biāo)（如病理學(xué)檢查或使用組織勻漿測定的指標(biāo)）無法使用自身對照。限量實驗：毒性較小的化學(xué)物若無法求得LD50，則進(jìn)行限量實驗，單次染毒劑量5g/kg（體重），食品毒理學(xué)實驗——15g/kg（體重）。3、觀察一般要求計算實驗動物接觸化合物之后兩周內(nèi)的總死亡數(shù)。對于一些速死性化合物求其LD50(LC50)也可僅計算24小時的死亡率。也可僅計算24小時的死亡率，有些速殺性化合物的24小時LD50與兩周LD50值往往沒有差別。但應(yīng)注明是多少時間的LD50值，以便于在進(jìn)行毒性比較時有共同的基礎(chǔ)。觀察內(nèi)容：（1）死亡情況：死亡數(shù)量和時間（2）動物體重（3）中毒反應(yīng)癥狀：每天一次，觀察皮膚、毛、眼和黏膜改變病理學(xué)檢查：對死亡動物和實驗結(jié)束后所有動物進(jìn)行解剖，觀察器官是否病變。4、LD50計算LD50是經(jīng)統(tǒng)計學(xué)計算得到的毒性參數(shù)，并可報告其95％可信限。LD50(LC50)值是一個統(tǒng)計量，較少受實驗動物個體易感性差異的影響，較為準(zhǔn)確，因此是最重要的急性毒性參數(shù)，也用來進(jìn)行急性毒性分級。對于非致死性指標(biāo)的量化問題，可以利用ED50(medianeffectivedose)和相應(yīng)的劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線來解決。ED50是指一次給予實驗動物某種化學(xué)物引起動物群體中50％的個體出現(xiàn)某種特殊效應(yīng)的劑量，該指標(biāo)也是通過統(tǒng)計學(xué)計算處理得到的。圖6-1圖6-1急性毒性的劑量-反應(yīng)曲線關(guān)系曲線模式圖由圖6-1可以看到在以對數(shù)劑量為橫軸，死亡率為縱軸的圖中，隨劑量增加，累積死亡率也增加，呈“S”形曲線；如果以死亡頻率為縱軸時，則不同劑量下死亡頻率的分布呈正態(tài)分布，為典型的“鐘罩”型；而將累積死亡率轉(zhuǎn)換為概率單位后作為縱軸時，則對數(shù)劑量與死亡率(概率單位)的圖形則表現(xiàn)為直線。因此我們可以將劑量對數(shù)值與死亡率(概率單位)的關(guān)系，進(jìn)行直線回歸，用最小二乘法求出a、b值。代入直線方程：y＝a十bX。式中，X為劑量對數(shù)值，y為死亡率的概率單位。利用此式即可求得受試化學(xué)物的LD50及其95％可信區(qū)間。（二）急性毒性實驗的其他方法對經(jīng)典的急性毒性試驗和LD50的意義，多年來一直有不同的意見：①消耗的動物量大，按經(jīng)典法的要求測LD50，一次實驗需要60～100只動物。②獲得的信息有限，LD50的值又不能等同于急性毒性，死亡僅僅是評價急性毒性的許多觀察終點之一?；瘜W(xué)物單次大劑量急性中毒，動物多死于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管功能障礙，并不能很好地顯示出各自的毒作用特征，另外，由于死亡迅速，各種器質(zhì)性變化尚未發(fā)展，不能顯示出靶器官的病變。③測得的LD50值實際上僅是近似值，1977年歐洲共同體組織了13個國家的100個實驗室，統(tǒng)一主要的實驗條件對5種化學(xué)物的LD50進(jìn)行測定。根據(jù)收集到的80個實驗室的結(jié)果分析，結(jié)果仍然存在相當(dāng)大的差別，可達(dá)2.44～8.38倍(表6-1)。五種化合物的LD50值的實驗室間變異化合物范圍(mg/kg)比值(最大值／最小值)五氯酚74～6208.38水楊酸鈉930～23282.50苯胺479～11692.44乙酰苯胺723～30604.23氯化鎘105～4824.591、固定劑量法固定劑量法是由英國毒理學(xué)會1984年提出，OECD于1992年正式采用。這種方法與以往方法不同的是它不以動物死亡作為觀察終點，這個方法可以利用預(yù)先選定的或固定的一系列劑量染毒，從而觀察化學(xué)物的毒性反應(yīng)來對化學(xué)物的毒性進(jìn)行分類及分級。實驗選擇的劑量范圍是5、50和500mg/kg，而最高限量是2000mg/kg。首先用50mg/kg的受試物給予10只實驗動物(雌、雄各半)。如果存活率低于100％，則再選擇一組動物給予5mg/kg的受試物。如果存活率仍低于100％，則將該受試物歸于“高毒”類，反之歸于“有毒”類。如果給予50mg/kg受試物后存活率為100％，但有毒性表現(xiàn)，則不需進(jìn)一步試驗而將其歸于“有害”類。如果給予50mg/kg后存活率為100％，而且沒有毒性表現(xiàn)，繼續(xù)給另外一組動物500mg/kg的受試物，如果存活率仍為100％，而且沒有毒性表現(xiàn)時，則給予2000mg/kg受試物進(jìn)行觀察，如果仍然100％存活，將受試物歸于“無嚴(yán)重急性中毒的危險性”類。對于固定劑量法的結(jié)果評價可見表6-4。OECD組織了對固定劑量法國際性的驗證(VanDenHeuvell990)，11個國家的33個實驗室用固定劑量法和OECD(1981)規(guī)定的經(jīng)典急性毒性試驗法進(jìn)行實驗。實驗結(jié)果表明，①毒性分級：比較了30個化合物的兩種試驗法所得結(jié)果，根據(jù)歐共體急性口服毒性的分級標(biāo)準(zhǔn)，516次固定劑量法試驗中，有414次實驗結(jié)果的毒性分級與LD50的分級相同，一致性為80.2％。②毒性反應(yīng)：從毒性反應(yīng)的類別、出現(xiàn)和持續(xù)的時間、消失的時間等方面分析，兩種試驗方法未顯出明顯差別。③實驗所用動物數(shù)：LD50經(jīng)典急性毒性試驗，平均每個化合物用大鼠24.2只，固定劑量法平均用大鼠14.8只，明顯比前者少。表6-4單次口服固定劑量法試驗結(jié)果的評價劑量（mg/kg）試驗結(jié)果存活率〈100%100%存活，毒性表現(xiàn)明顯100%存活，無明顯中毒表現(xiàn)5.0高毒LD50≤25mg/kg有毒用50mg／kg試驗50.0有毒或高毒有害用500mg/kg試驗用5mg/kg試驗LD50200～2000mg/kg500.0有毒或有害LD50＞2000mg/kg用2000mg/kg試驗用50mg/kg試驗2000.0用500mg/kg試驗該化學(xué)物無嚴(yán)重急性中毒的危險性2急性毒性分級法(acutetoxicclassmethod)傳統(tǒng)的急性毒性試驗方法以死亡為終點，而固定劑量法以明顯的毒性體征作終點。OECD(1996)急性經(jīng)口毒性分級法是分階段試驗法，每階段3只動物，根據(jù)死亡動物數(shù)，平均經(jīng)2～4階段即可判定急性毒性。所用動物少，仍可得到可接受的結(jié)論，此法基于生物統(tǒng)計學(xué)，并經(jīng)過OECD組織的國際證實研究(Schlede等，1994)。此法應(yīng)用于嚙齒類，首選大鼠，利用3個固定劑量25、200、2000mg/kg體重其中之一開始進(jìn)行試驗，根據(jù)實驗結(jié)果：①不需要進(jìn)一步試驗進(jìn)行分級；②下一階段以相同劑量的另一種性別試驗；③下一階段以較高或較低的劑量水平進(jìn)行(從200mg/kg體重開始的程序見圖6-3)。于確認(rèn)染毒動物存活后，進(jìn)行下一個性別或下一個劑量的實驗。動物觀察14天，染毒當(dāng)天觀察體征和死亡至少兩次，之后每日觀察一次。染毒前和每周測體重，所有動物均進(jìn)行大體解剖，必要時進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。圖6-3急性毒性分級法:以200mg/kg體重開始的試驗方案3.上、下移動法(up／downmethod)或階梯法，該法可用于觀察不同的終點，第二個動物接受化學(xué)物的劑量由第一只動物染毒后的反應(yīng)決定，如果動物死亡，則下一個劑量降低；如果動物存活則下一個劑量增高，但是實驗需要選擇一個比較合適的劑量范圍，使得大部分的動物所接受的化學(xué)物劑量都會在真正的平均致死劑量左右。如果劑量范圍過大，則需要有更多的動物來進(jìn)行觀察。對于該法進(jìn)行改進(jìn)以后，上、下移動法則只需要6～9只動物。Lipnick等(1995)比較了上下法、固定劑量法和經(jīng)典LD50法，根據(jù)EEC分級系統(tǒng)對化學(xué)品急性毒性分級，上下法和經(jīng)典法一致性為23／25，上下法與固定劑量法一致性為16／20。上下法需一個性別6～10只動物，少于另兩種方法。三、急性毒性分級目前國際上對外源化學(xué)物急性毒性分級的標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一。世界衛(wèi)生組織的毒性分級標(biāo)準(zhǔn)可見表6-2。歐洲共同體的急性口服毒性分級標(biāo)準(zhǔn)為：高毒(VeryToxic，LD50＜25mg/kg)、有(UncIassified，LD50＞2000mg/kg)等四個等級。除了參考國際上的幾種分級標(biāo)準(zhǔn)外，我國于1978年提出了農(nóng)藥及工業(yè)毒物急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)及農(nóng)藥急性毒性分級暫行標(biāo)準(zhǔn)。目前我國食品毒理則沿用了國際上六級標(biāo)準(zhǔn)，即極毒、劇毒、中等毒、低毒、實際無毒、無毒(表6-3)。表6-2外源化學(xué)物急性毒性分級(WHO)毒性分級大鼠一次經(jīng)口LD50(mg/kg)6只大鼠吸入4小時死亡2～4只的濃度(ppm)兔經(jīng)皮LD50(mg/kg)對人可能致死劑量單位體重（g/kg）總重(g/60kg)劇毒高毒中等毒低毒微毒＜11～50～500～50000～＜1010～100～1000～10000～＜55～44～350～2180～＜0.050.05～0.5～5～＞150.133025＞1000表6-3我國食品毒理急性毒性分級法[1994]急性毒性分級大鼠經(jīng)口LD50(mg/kg)大致相當(dāng)于體重為70kg人的致死劑量6級(極毒)＜1稍嘗，＜7滴5級(劇毒)1～507滴～1茶匙4級(中等毒)51～5001茶匙～35克3級(低毒)501～500035～350克2級(實際無毒)5001～15000350～1050克1級(無毒)＞15000＞1050克第三節(jié)亞慢性、慢性毒性及其評價方法一、亞慢性和慢性毒性試驗的概念亞慢性毒性(subchronictoxicity)是指實驗動物連續(xù)(通常1～3個月)重復(fù)染毒外源化學(xué)物所引起的毒性效應(yīng)；慢性毒性(chronictoxiciy)是指實驗動物長期染毒外源化學(xué)物所引起的毒性效應(yīng)。一般是連續(xù)染毒6個月至兩年，甚至終生染毒。二、亞慢性和慢性毒性試驗的目的1.確定受試物亞慢性和慢性毒性的效應(yīng)譜，對在急性及亞急性毒性試驗中發(fā)現(xiàn)的毒作用提供新的信息，并發(fā)現(xiàn)在急性及亞急性毒性試驗中未發(fā)現(xiàn)的毒作用；2.研究受試物亞慢性和慢性毒作用的靶器官；3.研究受試物亞慢性和慢性毒性劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系，確定其觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)和未觀察到有害作用的劑量(NOAEL)，提出此受試物的安全限量參考值；4.研究受試物亞慢性和慢性毒性損害的可逆性；5.亞慢性毒性試驗為慢性毒性試驗的劑量設(shè)計及觀察指標(biāo)選擇提供依據(jù)；6.確定不同動物物種對受試物亞慢性和慢性毒效應(yīng)的差異，為將毒性研究結(jié)果外推到人提供依據(jù)。三、亞慢性毒性和慢性毒性的評價方法（一）實驗動物一般要求選拔兩種實驗動物，一種為嚙齒類，另一種為非嚙齒類，如大鼠和狗，以便全面了解受試物的毒性特征。實驗動物最好為純系甚至同窩動物均勻分布于各劑量組。性別要雌雄各半。亞慢性實驗每組20只以上大鼠，慢性實驗每組40－100只。由于亞慢性毒性試驗期較長，所以選擇被動物的體重(年齡)應(yīng)較小，如小鼠應(yīng)為15g左右，大鼠100g左右。慢性毒性實驗動物年齡應(yīng)更小小，大鼠和小鼠應(yīng)為初斷奶者，即小鼠出生后3周，體重1012g；大鼠出生后34周，體重5070g。（二）染毒途徑盡量模擬人類的接觸方式；應(yīng)與預(yù)期進(jìn)行慢性毒理試驗的接觸途徑相一致，染毒時間每日應(yīng)定時，以維持動物血液中濃度穩(wěn)定。常用的染毒途徑是經(jīng)胃腸道、經(jīng)呼吸道和皮膚染毒。（三）染毒期限工業(yè)接觸毒物：亞慢性毒性——1～3個月，慢性毒性——6個月環(huán)境毒物：亞慢性毒性——3～6個月，慢性毒性——12個月以上如果慢性毒性實驗與致癌實驗結(jié)合，染毒期限最好是接近或等于終生染毒。（四）劑量分組至少3個劑量組和1個對照組。高劑量組：出現(xiàn)較明顯的毒性效應(yīng)，死亡率小于10％或無死亡中劑量組：輕微毒性，即觀察到最低有害作用劑量（LOAEL）低劑量組：不出現(xiàn)中毒反應(yīng)，即未觀察到有害作用劑量（NOAEL）亞慢性毒性實驗：可參考兩個數(shù)值，一是以急性毒性的閾劑量為亞慢性試驗的最高劑量；一是以此化合物L(fēng)D50的1/201/5為最高劑量。慢性毒性實驗：劑量的選擇可參考三組數(shù)據(jù)。亞慢性NOAEL或其1/51/2劑量為慢性毒性試驗的最高劑量，以這一閾劑量的1/501/10為慢性毒性試驗的預(yù)計閾劑量組，并以其1/100為預(yù)計的慢性無作用劑量組慢性試驗的LOAEL的1/2、1/4、1/8分三組3、急性毒性的LD50劑量為出發(fā)點，即以LD50的1/10劑量為慢性試驗的最高劑量。以LD50的1/100為預(yù)計慢性閾劑量，以LD50的1/1000為預(yù)計的無作用劑量組。（五）觀察指標(biāo)1、中毒癥狀：每日觀察動物有無中毒癥狀和程度，外觀和行為有無異常2、體重：每周稱重一次3、食物利用率：記錄每日飼料消耗量