As2O3抑制人淋巴瘤Raji細(xì)胞增殖及VEGF表達(dá)

作者：喻鎂佳，段勇，劉華，張學(xué)美，李惠民

【摘要】本研究探討在As2O3作用下人淋巴瘤Raji細(xì)胞的增殖及VEGFmRNA表達(dá)的變化。采用改良MTT方法觀察As2O3對(duì)Raji細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)；采用半定量RT-PCR方法檢測(cè)As2O3對(duì)Raji細(xì)胞VEGF121和VEGF165mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明：As2O3對(duì)Raji細(xì)胞的作用表現(xiàn)時(shí)間、劑量依賴(lài)性的增殖抑制效應(yīng)，建立回歸方程為：IR＝+。半定量RT-PCR方法檢測(cè)顯示，Raji細(xì)胞同時(shí)表達(dá)VEGF121和VEGF165兩種剪切變異體，二者的表達(dá)水平相當(dāng)。VEGF121和VEGF165mRNA表達(dá)量與As2O3作用時(shí)間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，且VEGF的各異構(gòu)體對(duì)藥物的反應(yīng)具有差異性，VEGF165mRNA表達(dá)下調(diào)早且有持續(xù)性。但在所選濃度組中未發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的相關(guān)關(guān)系。結(jié)論：As2O3既可抑制Raji細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，亦可通過(guò)下調(diào)VEGFmRNA表達(dá)而產(chǎn)生抗血管新生效應(yīng)，且小劑量、長(zhǎng)時(shí)程給藥時(shí)結(jié)果亦然。

【關(guān)鍵詞】三氧化二砷；淋巴瘤；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；血管新生

InhibitedProliferationofB-lymphomaRajiCellsandDown-regulatedExpressionofVEGFbyArsenicTrioxide

AbstractThisstudywasaimedtoinvestigatetheeffectsofAs2O3onproliferationofBlymphomaRajicellandtostudytheexpressionchangesofVEGFmRNA.ThemodifiedMTTwasadoptedtoevaluatetheeffectofAs2O3onproliferationofRajicells.Semi-quantitativeRT-PCRwasusedtodetecttheexpressionofVEGF121andVEGF165mRNAinRajicellsexposedtoAs2O3.TheresultsshowedthattheAs2O3significantlyinhibitedtheproliferationofRajicells，therelationshipbetweentheinhibitionrateandtheconcentrationsofAs2O3wasdose-andtime-dependent.TheVEGF121andVEGF165mRNAexpressionswerefoundinRajicells，andbothwerewell-matchedinexpressionlevels.AftertreatmentofAs2O3at1μmol/Lfor48hours，theexpressionlevelsofVEGF121andVEGF165mRNAweresignificantlydown-regulatedanddemonstratednegativecorelationwiththetimeofexposuretoAs2O3.OtherwisesomedifferencewereobservedineffectsofAs2O3onVEGF121andVEGF165，theexpressionofVEGF165mRNAwasdown-regulatedearlyerandlongerthanthatofVEGF121，whilenosimilarcorrelationwasfoundinselectedconcentrationgroups.ItisconcludedthatAs2O3cansignificantlyinhibitthegrowthofRajicellsandmayexerteditsanti-angiogenesiseffectsbydown-regulatingtheVEGFmRNAexpressioneveninalowconcentrationforalongterm.

Keywordsarsenictrioxide;lymphoma;vascularendothelialgrowthfactor(VEGF);angiogenesis

自從As2O3用于急性早幼粒細(xì)胞白血病治療以來(lái)，其良好的療效和特異的作用機(jī)制已引起人們關(guān)注。多數(shù)研究認(rèn)為誘導(dǎo)凋亡是As2O3的主要作用機(jī)制，但也有報(bào)道As2O3可下調(diào)慢性髓性白血病患者骨髓細(xì)胞培養(yǎng)上清液中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)［1］，因此As2O3的抗腫瘤機(jī)制中亦可能包含有抗血管生成效應(yīng)。本研究在進(jìn)一步觀察As2O3對(duì)人淋巴瘤Raji細(xì)胞增殖活性影響的基礎(chǔ)上，初步探討其對(duì)淋巴瘤細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)的影響。

材料和方法

藥物

As2O35ml∶5mg，分子量：126，原液濃度8mmol/L，使用時(shí)用無(wú)菌RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

細(xì)胞株的培養(yǎng)和傳代

人Burkitt淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞，接種于含15％滅活小牛血清的新鮮RPMI1640培養(yǎng)液中，置37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，視生長(zhǎng)狀況每2-3天對(duì)細(xì)胞換液傳代1次，所有實(shí)驗(yàn)均用指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)

接種細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板上，每孔接種量為100μl，細(xì)胞密度為6×104/ml，加入不同濃度的As2O3共同溫育，同時(shí)設(shè)定空白及陰性對(duì)照，分別于各時(shí)間點(diǎn)用MTT方法測(cè)定其抑制率。

抑制率=［/OD陰性孔］×100%

VEGFmRNA表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)

按預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)收集未加藥組及各給藥組樣本，調(diào)整細(xì)胞數(shù)2×106個(gè)，離心棄上清。嚴(yán)格按照試劑盒步驟提取總RNA后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按RT-PCR試劑盒對(duì)cDNA產(chǎn)物行PCR擴(kuò)增，體系為：cDNA2μl，上、下游引物各μmol/L，MgCl2mmol/L，dNTP2mmol/L，Taq1U/L，10×Bufferμl，加滅菌三蒸餾水至25μl。瞬時(shí)離心后置PCR擴(kuò)增儀上：95℃2分鐘預(yù)變性；95℃45秒，63℃45秒，72℃45秒，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘，結(jié)束反應(yīng)。PCR引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成，擴(kuò)增VEGF的兩種剪接變異體：VEGF121和VEGF165，擴(kuò)增產(chǎn)物均為254bp。

上游引物：5′-CCCTGATGAGATCGAGTACATCTT-3′ex3；下游引物：VEGF121：5′-GCCTCGGCTTGTCACATTTT-3′ex5/8，VEGF165：5′-AGCAAGGCCCACAGGGATTT-3′ex5/7；β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物為117bp，P1：5′-AACGGCTCCGGCATGTGCAA-3′；P2：5′-CTTCTGACCCATGCCCACCA-3′。

對(duì)特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后采用GelDoc1000紫外圖象分析系統(tǒng)和配套分析軟件半定量分析其表達(dá)變化，測(cè)相對(duì)值，相對(duì)值=灰度VEGF/灰度β-actin。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用多重線(xiàn)性回歸，雙因素相關(guān)分析及方差分析。

結(jié)果

As2O3對(duì)Raji細(xì)胞的增殖抑制作用

在1-50μmol/LAs2O3的濃度范圍內(nèi)，隨藥物濃度的增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)，Raji細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制。通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：1μmol/L的As2O3作用48小時(shí)時(shí)Raji細(xì)胞的形態(tài)改變不明顯，仍可見(jiàn)分裂相；但8μmol/L的As2O3作用48小時(shí)時(shí)多數(shù)細(xì)胞胞體變形，細(xì)胞周?chē)袛?shù)個(gè)小泡狀突起，核染色質(zhì)濃縮邊聚。以抑制率為因變量，以濃度、時(shí)間(time)為自變量，建立回歸方程：IR＝+。Table1.InhibitioneffectofAs2O3onRajicellatdifferentconcentrationsforeverytimepoint(略)

As2O3對(duì)Raji細(xì)胞VEGF121、VEGF165mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Raji細(xì)胞同時(shí)表達(dá)VEGF121和VEGF165mRNA，二者表達(dá)水平相當(dāng)，各試驗(yàn)濃度As2O3持續(xù)作用不同時(shí)間均可使Raji細(xì)胞VEGF121、VEGF165mRNA的表達(dá)下調(diào)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，VEGF121和VEGF165mRNA的表達(dá)在各濃度組間無(wú)顯著性差異，但二者的下調(diào)變化與藥物作用時(shí)間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系：rsv121=-，；rsv165=-，。Table2.VEGF121levelfromRajicellsafterexposuretoAs2O3atdifferentconcentrationsonthefollowingtime(略)Table3.VEGF165levelfromRajicellsafterexposuretoAs2O3atdifferentconcentrationsonthefollowingtime(略)

討論

Raji細(xì)胞是人B細(xì)胞淋巴瘤的建株細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)了As2O3對(duì)Raji細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，As2O3能明顯抑制Raji細(xì)胞的增殖。８μmol/L和１μmol/L的As2O3在第24小時(shí)和第72小時(shí)對(duì)Raji細(xì)胞的抑制率分別是％、100％和％、％，效應(yīng)呈時(shí)間、劑量依賴(lài)性，建立回歸方程：IR＝+。國(guó)內(nèi)、外同類(lèi)研究顯示：As2O3發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的有效濃度，除了在NB4細(xì)胞可低至μmol/L，對(duì)其它多數(shù)腫瘤細(xì)胞均在2-10μmol/L水平，顯示出劑量依賴(lài)性的增殖抑制效應(yīng)。Zhu等［2］報(bào)道，1μmol/L的As2O3僅輕度抑制Raji細(xì)胞的增殖，其機(jī)制主要是延長(zhǎng)細(xì)胞周期時(shí)間。聶林等［3］對(duì)As2O3誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡的體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：4μmol/L的As2O3作用Raji細(xì)胞48小時(shí)后Raji細(xì)胞凋亡率為40％左右。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，4-8μmol/L水平產(chǎn)生的顯著的增殖抑制的原因，應(yīng)該認(rèn)為主要與凋亡機(jī)制有關(guān)。目前的研究提示，砷劑具有多方面的抗腫瘤作用，誘導(dǎo)凋亡是被多數(shù)研究所證實(shí)，而且是較肯定的機(jī)制之一，而有關(guān)其抗血管生成作用目前較肯定的是能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。但腫瘤血管新生的多環(huán)節(jié)、多步驟的協(xié)同發(fā)生提示我們：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)等均是抗血管生成的重要靶點(diǎn)［4］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是調(diào)節(jié)血管新生的中心環(huán)節(jié)，其異常高表達(dá)是大多數(shù)腫瘤的重要特征［5，6］。VEGF基因位于染色體6P21，3，經(jīng)轉(zhuǎn)錄水平的剪切，可產(chǎn)生5個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄子，VEGF121、145、165、189、206。它們各具不同的生化和生物學(xué)特性，其中VEGF121和VEGF165為分泌型細(xì)胞因子，具有直接誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，占總VEGF的78％。VEGF165因比VEGF121多一段Exon7而具備與肝素及細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合的能力，甚至多一些特異性的受體。因此研究者普遍認(rèn)為VEGF165的活性高于VEGF121［7，8］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR半定量分析顯示：Raji細(xì)胞同時(shí)表達(dá)VEGF121及VEGF165兩種異構(gòu)體，表達(dá)水平相當(dāng)(VEGF121：±，VEGF165：±，)。加入As2O3后，VEGF165及VEGF121mRNA的表達(dá)均隨藥物作用時(shí)間的推移出現(xiàn)下調(diào)，二者均顯示與作用時(shí)間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。VEGF165對(duì)As2O3的作用相對(duì)敏感，24小時(shí)即出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，至48小時(shí)表達(dá)被進(jìn)一步抑制；而VEGF121mRNA的表達(dá)至藥物作用48小時(shí)后才出現(xiàn)明顯下調(diào)。該結(jié)果提示：As2O3抑制Raji細(xì)胞表達(dá)VEGF各異構(gòu)體具有選擇性，由于其對(duì)高活性的VEGF165的抑制作用更加明顯，故而推測(cè)As2O3的抗血管生成活性可能較高。此外，對(duì)MTT和RT-PCR兩部分實(shí)驗(yàn)聯(lián)合分析劑量-效應(yīng)關(guān)系還發(fā)現(xiàn)：1μmol/L的As2O3對(duì)Raji細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)弱，持續(xù)作用72小時(shí)方達(dá)30％左右的抑制率；而1μmol/L的As2O3對(duì)VEGFmRNA的表達(dá)卻可通過(guò)時(shí)間的積累產(chǎn)生顯著的下調(diào)效應(yīng)，這提示As2O3在低濃度水平即可有效下調(diào)VEGFmRNA的表達(dá)。目前，實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法因其能準(zhǔn)確定量而漸被廣泛應(yīng)用，但設(shè)計(jì)合適的引物及探針存在一定難度，且國(guó)內(nèi)、外文獻(xiàn)尚未見(jiàn)用該法檢測(cè)VEGFmRNA各剪切異構(gòu)體表達(dá)的報(bào)道，因此，本研究半定量RT-PCR的結(jié)果將為后續(xù)準(zhǔn)備開(kāi)展的QRT-PCR提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

總之，As2O3對(duì)Raji細(xì)胞作用表現(xiàn)有多方面，既可抑制細(xì)胞增殖又能下調(diào)其VEGFmRNA表達(dá)。鑒于這種多面性進(jìn)一步的研究需探尋一個(gè)能在多環(huán)節(jié)發(fā)揮協(xié)同作用的最低有效劑量，且上述體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也需在后繼的體內(nèi)研究及臨床實(shí)踐中更全面的證實(shí)。目前，腫瘤的治療更強(qiáng)調(diào)一種多渠道、多信號(hào)通路阻斷的綜合治療模式，As2O3多環(huán)節(jié)的作用機(jī)制也許正適合該治療模式的需要。因此，我們推測(cè)As2O3有可能成為一種更為有效的新的淋巴瘤聯(lián)合化療方案的藥物。

【參考文獻(xiàn)】

1李麗，張日，朱子玲.三氧化二砷下調(diào)慢性髓系白血病骨髓細(xì)胞VEGF的表達(dá).中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2003；11：263-265

2ZhuXH，ShenYL，JingYK，etal.Apoptosisandgrowthinhibitioninmalignantlymphocytesaftertreatmentwitharsenictrioxideatclinicallyachievableconcentrations.JNat