免疫組化染色過(guò)程中的基本技術(shù)雖然免疫組化染色方法有多種，但在染色中都需要采取一些基本的技術(shù)方法。一、蛋白酶消化技術(shù)目的：使抗原決定簇充分暴露出來(lái)，并使組織的通透性升高，以利于抗原抗體最大限度結(jié)合，增強(qiáng)特異性染色。胰蛋白酶、胃蛋白酶是實(shí)驗(yàn)室中最常用的兩種消化酶。消化時(shí)間因組織而異，一般為5～30分鐘。消化結(jié)束后要充分洗滌。1.0.1%胰蛋白酶：胰酶0.1g+0.1%cacl,用0.1mol/LNaOH調(diào)PH至7.8，消化溫度為室溫或37℃，5～30min。2.0.4%胃蛋白酶：胃蛋白酶0.4g+0.1mol/LHcl100mol。二、非特異性染色控制造成非特異性染色的原因：1.從組織方面分析：自發(fā)的熒光、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、內(nèi)源性生物素等；2.從試劑方面看：用于標(biāo)記的酶和熒光不純或標(biāo)記過(guò)量等原因引起。消除非特異性染色的方法：最常用的方法是再加第一抗體前，先用制備第二抗體動(dòng)物的非特異血清作用10～30min,以封閉組織中帶電荷的基團(tuán)，避免與第一抗體非特異性結(jié)合。此外，如作免疫熒光染色時(shí)，可用0.01%～0.05%伊文斯蘭稀釋熒光抗體；如作免疫酶組織化學(xué)染色時(shí)，再加一抗前先用0.3%～3%的H2O2甲醇溶液處理切片5～30min.三、對(duì)照試驗(yàn)為了對(duì)染色結(jié)果作出正確的判斷，染色中用已知抗原為陽(yáng)性的標(biāo)本與帶檢測(cè)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行免疫組化染色，呈陽(yáng)性反應(yīng)者為陽(yáng)性對(duì)照。如果用確認(rèn)不含已知抗原的標(biāo)本作對(duì)照，染色結(jié)果為陰性者稱陰性對(duì)照。除此之外，空白、替代、吸收和抑制試驗(yàn)等也屬于陰性對(duì)照。

選擇對(duì)照片舉例檢測(cè)抗原陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照Keratin正常鱗狀上皮淋巴結(jié)分化型鱗癌平滑肌瘤S-100神經(jīng)纖維平滑肌瘤神經(jīng)鞘瘤鱗癌/腺癌CEA分化性胃癌淋巴結(jié)未分化胃癌軟組織腫瘤當(dāng)染色結(jié)果所顯示的是陽(yáng)性對(duì)照片呈陽(yáng)性、陰性對(duì)照片呈陰性時(shí)，表明被檢測(cè)切片的標(biāo)記結(jié)果正確可靠。標(biāo)本號(hào)檢測(cè)標(biāo)本陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照替代抗原對(duì)照結(jié)論1++--含抗原2-+--不含抗原3----操作錯(cuò)誤4++++非特異反應(yīng)5++-+非特異反應(yīng)6+---陽(yáng)性對(duì)照差四、抗體的分裝、稀釋、滴加及保存1.抗體的分裝目的：將一次不能使用完的抗體根據(jù)用量進(jìn)行分裝。分裝后的抗體宜保存在-20～-40的低溫冰箱中，一般數(shù)年有效。分裝后的抗體盡量一次用完，避免反復(fù)凍融而使抗體效價(jià)降低。2.抗體的稀釋抗原抗體的結(jié)合除了與它們之間的特異性外，還與兩者之間的分子比例密切相關(guān)。如果抗體分子過(guò)多，陽(yáng)性反應(yīng)減弱甚至出現(xiàn)假陰性。（1）影響抗體稀釋度的因素1）抗體的濃度：抗體濃度越高稀釋度就越高。2）抗體中的非特異蛋白的含量：3）孵育時(shí)間：適當(dāng)延長(zhǎng)可提高抗體的稀釋度。4）染色方法：不同染色方法的靈敏度有別，其抗體的稀釋度也不一樣，如間接法較直接發(fā)靈敏；ABC法較PAP靈敏。靈敏度越大抗體的稀釋度可隨之提高。（2）抗體稀釋度的測(cè)定方法：為準(zhǔn)確了解抗體的稀釋度，常將抗體按不同濃度稀釋，對(duì)已知抗原為陽(yáng)性的切片進(jìn)行染色，并將特異性染色與背景染色的強(qiáng)弱以“+”的多少表示，測(cè)定方法有以下兩種：1）直接測(cè)定法在其他條件已知的情況下將一抗按1：50、1：100、1：200、1:400、1：500等濃度稀釋，分別滴加在切片上染色，同時(shí)設(shè)定陰、陽(yáng)性對(duì)照，染色結(jié)果可用下表表示。一抗稀釋度特異性染色非特異性染色1：50++++++1:100++++++1:200++++++1:400++++1:500++—陰性對(duì)照——

一抗最佳稀釋度直接測(cè)定法從表中可以看出，當(dāng)一抗稀釋到1：400時(shí)染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，背景染色少。2）棋踐盤(pán)測(cè)貸定法當(dāng)對(duì)答一抗毅、二屢抗或差三抗避的最淺佳稀分釋度吩都未弊知時(shí)癥，就梳必須豬采用畜此法乒進(jìn)行伏測(cè)定茅。在實(shí)料際工跳作中勤，試畢劑公塵司所蒸售抗具體均賄已標(biāo)請(qǐng)明該診抗體脾的稀趨釋度焦。（3）抗?jié)q體的纏稀釋怒方法常用0.額01灶mo離l/套L揉PB惑S或TB爪S緩沖恢液即肆可。覆如稀羞釋后眾的抗梁體需偵長(zhǎng)時(shí)肚間保篇存，珍則另西有配妄制方搜法：謹(jǐn)明膠+T穴BS接+牛血經(jīng)清+N形aN3，4℃度保筐存。3.滴加映抗體奧的方宰法免疫晌組化禍染色薪時(shí)，捆再不鹿使組崗織干沖燥的孔前提嫩下，庭切片嶺上所捎滴加襪抗體歸溶液駁應(yīng)以慘充分懲覆蓋陡組織呢切片月為準(zhǔn)隔，一賀般用自微量蕩加樣迅器加30~50亦μl即可銀。加杏液前滲常用四蠟筆渡或特闖制免止疫組吊化筆熔在組?？椫莛噰?huà)回一個(gè)經(jīng)圈，禁以阻仆止溶至液擴(kuò)早散。4.抗體成的保襪存及董與有眨效期（五宣）孵嬌育方午法及短時(shí)間抗體禮的孵恐育應(yīng)侮在特垃質(zhì)的紫濕盒蘿中進(jìn)鋒行，恥以免訪切片先因水掙分蒸蹲發(fā)而拆干燥桶、使若染色干失散呆。孵育民時(shí)間關(guān)常為挨一小添時(shí)左嘩右，概溫度壺為室豆溫或37言℃.孵育散時(shí)間鼠也可次根據(jù)閘抗體鞠的效占價(jià)及評(píng)檢測(cè)毅方法抵的靈蹤蝶敏度呀進(jìn)行剃適當(dāng)頂?shù)难觽€(gè)長(zhǎng)或朗縮短系，延弊長(zhǎng)孵各育時(shí)索常在4℃冰箱敵過(guò)夜瘡。（六樹(shù)）切挨片的罰洗滌滴加滴抗提美前應(yīng)劉用0.尸01敏mo偏l/用LP榴BS充分昏洗滌刪切片擋，可童浸洗傅或淋蓄洗，損每次10消mi楚n,共3次。（七鋸）顯米色顯色卻是免悠疫酶醉組織冒化學(xué)喘方法碰的步熊驟之猾一，兔將配沙制好狀的顯飲色液黃滴加結(jié)在切批片上館，通慎過(guò)酶鵲的催歐化作橡用使教顯色慣液中懇的底濃物產(chǎn)創(chuàng)生著蟻色沉比淀。嶼光鏡俘下觀處察顯蠅色效嗎果，丈以控駱制染霉色時(shí)偏間，齊一般蕩室溫橋下顯趣色5～15增mi仁n即可脆。不買同的騰酶所惱用底尤物不端同，抄常在系顯色聾前臨廣時(shí)用桂緩沖茫液配虧制。1.辣根預(yù)過(guò)氧悟化物撤酶（HR渴P）顯仆色液陷的配其制：HR別P+瞇DA改B+財(cái)H2O2（二翁氨基漢聯(lián)苯餡胺）=顯色惕（棕脾黃）用硫讓酸氨盒鎳或杠鋨酸叉處理巖可使DA巴B的顯堂色加絨深。?DA第B—浪H2張O2的配運(yùn)制1.在5m除ol殖0姜.0奧5m當(dāng)ol描P這H7價(jià).6Tr間is—HC僚l中加飾入2m疑g傳DA錘B反復(fù)炊吹打楚，使DA親B充分柏溶解肺；2.軋0.剃5%肥H2垂O2取30腔%的H2石O2格1串00謊μl，加良蒸餾太水6m需ol，充診分混召勻、皇密封坡。3.臨用逮前在DA促B液中初加入0.插5%顧H2晃O2混勻例后立變即使明用。(八)染色桐結(jié)果圍的判繼斷在完千成免紙疫組瘦化染櫻色后魚(yú)，對(duì)頌標(biāo)記份結(jié)果像的判斬?cái)嚓P(guān)吵系到趙診斷授的正供確與乎否。鑼理想凱的免笑疫組銜化染蹄色結(jié)追果陽(yáng)瞧性反嫌應(yīng)部厘位明扎顯，濤且背沖景清產(chǎn)晰。根據(jù)赤抗原恥的分組布部叨位不鍛同，設(shè)陽(yáng)性狂染色順可能芳顯示倦在細(xì)抬胞內(nèi)申外，狼其中熱以細(xì)罩胞質(zhì)沉為主貢。陽(yáng)性原細(xì)胞值的標(biāo)逆準(zhǔn)是需陽(yáng)性閥顆粒毅隨抗躬原分禾布；凍且細(xì)盼胞邊權(quán)界清釋楚，棵核結(jié)鞏構(gòu)清購(gòu)晰。如果脖細(xì)胞半之間胸染色范強(qiáng)度錯(cuò)相同漏，提體示可床能為俱非特場(chǎng)異性雹染色茅。邊緣鞏效應(yīng)——在石艦蠟切巾片的稻組織惠周圍蘆常有抓深染眼區(qū)，萄向中欺心逐篇漸變塊淡，沾此現(xiàn)啞象為須非特徐異性支染色脆。類抄似的盆現(xiàn)象潑在刀宴痕、訪折疊盜、壞生死、貌受擠訪壓區(qū)敲域出叢現(xiàn)。（九扒）襯習(xí)染在免障疫組速化染矛色后納，如偷再用荷其他效燃料似對(duì)切規(guī)片進(jìn)選行復(fù)聲染，博則能糕襯托號(hào)出組鞠織的跑形態(tài)秧結(jié)構(gòu)廟以利屆于對(duì)紀(jì)結(jié)果倆的分皮析。常用徐的襯田染劑掌有蘇近木素丟、甲霞基綠售、核留固紅革等，油究竟叫采用嚼哪種杏燃料全，應(yīng)沉根據(jù)圣所用笨的免置疫組病織化盾學(xué)染辟色方掀法，躁以及幟所呈噴現(xiàn)的布顏色殖確定鉆。如蝴陽(yáng)性魚(yú)染色次為紅束色或貼棕色肝，則辨蘇木乘素將旨細(xì)胞小核染搭成藍(lán)辮色。（十片）切前片的蓋脫水恒、透培明、紫封固染色擇后的產(chǎn)組織庸切片歡，須袍脫去煮組織犧中的唇水分謎使組梁織的贈(zèng)折光洞率提勉高，吃這一則過(guò)程買謂透負(fù)明。